周德剛，李朋朋*，師夢超，楊會鮮，楊絨娟

（洛陽惠中獸藥有限公司，國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心河南洛陽 471003）

自2018 年8 月以來非洲豬瘟在我國大部分省份暴發(fā)流行，2020 年2 月在湖南又發(fā)生了高致病性禽流感疫情，因此畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的生物安全防控工作日益嚴峻，人們對消毒劑的使用越來越重視，其中以過硫酸氫鉀復(fù)合鹽為主成分的消毒劑因其具有廣譜高效、低毒環(huán)保等特點而受到廣泛關(guān)注。過硫酸氫鉀復(fù)合鹽消毒劑具有較強的氧化能力，在水中經(jīng)過鏈式反應(yīng)連續(xù)產(chǎn)生活性氧，干擾病原體的DNA 和RNA 合成，從而殺滅病原體[1]，1989 年它被美國EPA 批準用于預(yù)防殺滅多種細菌和病毒的高效消毒劑，2005 年被美國農(nóng)業(yè)部用于機場出入境消毒，目前已在美國、英國等幾十個國家上市，被廣泛應(yīng)用于各型農(nóng)場、環(huán)境、飲水設(shè)備和空氣消毒。2020年國內(nèi)暴發(fā)新型冠狀病毒肺炎疫情，根據(jù)國家衛(wèi)健委辦公廳發(fā)布的關(guān)于部分消毒劑在新型冠狀病毒感染的肺炎疫情防控期間緊急上市的通知，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉被緊急批準用于肺炎疫情防控[2,3]。目前市售的國產(chǎn)過硫酸氫鉀復(fù)合物消毒劑存在有效成分下降較快、溶水性不合格及殺菌效果與原研產(chǎn)品相差較大等問題，影響了該產(chǎn)品在臨床中的推廣應(yīng)用。本文采用過硫酸氫鉀復(fù)合鹽為主成分，并輔以多種具有不同功能的輔料，制備出一種質(zhì)量與進口產(chǎn)品相當(dāng)?shù)倪^硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑，并對其穩(wěn)定性及消毒效果進行了研究，以期為畜牧養(yǎng)殖業(yè)提供一種合格高效的消毒產(chǎn)品。

1 試驗材料

1.1 試劑

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂，購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；小牛血清，購自鄭州益康生物有限公司；硫代硫酸鈉（五水），分析純，購自成都市科龍化工試劑廠；無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；單過硫酸氫鉀復(fù)合鹽，上海安爾信化學(xué)有限公司；十二烷基苯磺酸鈉，西隴化工股份有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

ABS-265 雙量程電子天平：METTLER TOLEDO；NU-425-400S生物安全柜：美國Nuaire；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；核酸蛋白測定儀：德國Eppendorf；微量移液器：德國Eppendorf 公司；渦旋混合器：德國IKA 公司；Seven Easy pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 菌株

大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌ATCC6538，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 消毒劑

過硫酸氫鉀復(fù)合物粉：照2 中方法自制。對照藥品：市售進口產(chǎn)品：批號1806BA0147。

2 試驗方法

2.1 過硫酸氫鉀復(fù)合物粉的制備

以過硫酸氫鉀復(fù)合鹽為主成分，氨基磺酸、蘋果酸、氯化鈉、十二烷基苯磺酸鈉、六偏磷酸鈉為輔料，參照專利US4822512[4]制得過硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑，所得消毒劑的有效氯含量不得低于10%。

2.2 穩(wěn)定性考察試驗

穩(wěn)定性試驗依據(jù)《獸用化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[5]進行設(shè)計，并按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第2357 號[6]進行樣品檢測。

2.2.1 有效成分檢測方法氯化鈉：取本品5g，精密稱定，置250mL 燒杯中，加水200mL 溶解后，立即照電位滴定法用硝酸銀滴定液（0.1mol/L）滴定，記錄硝酸銀滴定液消耗的體積量。每1mL硝酸銀滴定液相當(dāng)于5.844mg 的氯化鈉。

有效氯：取本品約10g，精密稱定，置1,000mL 量瓶中，加水適量振搖使溶解并稀釋至刻度，精密量取100mL，置250mL 錐形瓶中，加10%醋酸溶液10mL 和碘化鉀1g，振搖使溶解。用硫代硫酸鈉滴定液（0.1mol/L）滴定至近終點時，加淀粉指示液2mL，繼續(xù)滴定至溶液變成原料的粉紅色，并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。每1mL 的硫代硫酸鈉滴定液相當(dāng)于3.545mg 的氯。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗方法影響因素試驗：將過硫酸氫鉀復(fù)合物粉分別在照度4,500Lx、60℃、（25℃、75%濕度）的條件下放置10d，于0、5、10d 取樣檢測，考察樣品各指標的變化情況。

加速試驗：將過硫酸氫鉀復(fù)合物粉在40℃、相對濕度75%條件下放置6 個月，于第0、1、2、3、6 個月取樣檢測，考察樣品各指標的變化情況。

2.3 消毒效果評價試驗

按照《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》[7]第三章、第四章中規(guī)定進行，評價了過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對大腸桿菌8099 和金黃色葡萄球菌ATCC6538 的消毒效果，并與市售進口產(chǎn)品進行比較。

2.3.1 菌懸液制備取出菌種進行復(fù)蘇，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線。將接種后的培養(yǎng)基放在恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)20h。從生長良好的平板上挑取單克隆，在培養(yǎng)基上劃線，將接種后的培養(yǎng)基放在恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)20h。從傳代后的平皿上挑取4～10 個典型菌落至PBS 中，取部分菌懸液用核酸蛋白測定儀測定OD600值，將剩余菌懸液的OD600值調(diào)整至0.14～0.15，按此比例調(diào)整剩余菌液，混合均勻后進行2 倍稀釋，各菌液濃度約為1.0×107cfu/mL，備用。

2.3.2 中和劑選擇試驗用0.5%的硫代硫酸鈉溶液作為過硫酸氫鉀復(fù)合物粉的中和劑，用大腸桿菌進行中和選擇試驗，將試驗菌懸液與消毒劑按1∶9 比例作用5min，作用液與中和劑按1∶9 比例中和作用10min。試驗分以下6 組：第1 組：消毒劑+菌懸液，證明消毒劑在試驗濃度下是否有殺菌或抑菌作用；第2 組：（消毒劑+菌懸液）+中和劑，證明中和劑能否中和殘留消毒劑的抑菌作用；第3 組：中和劑+菌懸液，證明中和劑是否抑菌；第4 組：（消毒劑+中和劑）+菌液，證明消毒劑與中和劑的反應(yīng)產(chǎn)物有無抑菌作用；第5組：稀釋液+菌懸液，作為陽性對照；第6 組：稀釋液、中和劑、未接種培養(yǎng)基，作為陰性對照。第1 組、第2 組吸取消毒作用后的作用液原液接種瓊脂平皿，第3 組、第4 組、第5 組將消毒作用后的作用液用PBS 進行10 倍系列稀釋，取10-2、10-3 接種瓊脂平皿。

2.3.3 過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對微生物的定量殺滅試驗用無菌純化水溶解并稀釋過硫酸氫鉀復(fù)合物粉，吸取0.5mL 各試驗菌液置于4.5mL 各消毒劑中，渦旋混勻后開始計時，作用5min。計時結(jié)束后取菌藥混合液0.5mL 加入到4.5mL 中和劑中，渦旋混勻20s后開始計時，作用10min，計時結(jié)束后進行活菌計數(shù)。以PBS 代替消毒劑，其它操作同上述步驟，作為陽性對照組。同時設(shè)陰性對照組。當(dāng)消毒劑最高稀釋倍數(shù)的殺菌率均在99.9%以上時，可判定該稀釋倍數(shù)為消毒劑的有效殺菌濃度。按照下述公式計算殺菌率（Pt）。該試驗重復(fù)進行3 次，以3 次試驗殺菌率的平均值表示最終殺菌率。

殺菌率（Pt）=[（N0-Nt）/N0]×100%。其中N0=對照組的活菌數(shù)，Nt=試驗組的活菌數(shù)。

2.3.4 過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對微生物的定性殺滅試驗用無菌純化水溶解并稀釋過硫酸氫鉀復(fù)合物粉，取稀釋好的各菌液2.5mL加入到2.5mL 各濃度消毒劑中，混勻，于加入菌液后5、10、15、30、60min 從菌藥混合物中取0.5mL 加入到4.5mL 中和劑中，混合均勻后作用10min。取中和作用后的溶液0.5mL 加入到4.5mL 營養(yǎng)肉湯中，混合均勻后置于37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察結(jié)果，以PBS 代替消毒劑，其它操作同上述步驟，作為陽性對照組，同時設(shè)培養(yǎng)基對照（P），每種菌的定性試驗均重復(fù)3 次。培養(yǎng)物發(fā)生渾濁即表示有細菌生長，若不變渾濁，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至第7d，若仍不渾濁方可判為無菌生長。以無菌生長管消毒劑的最低濃度為最低殺菌有效濃度，以無菌生長管的最短消毒時間為該濃度殺菌最快有效時間。

3 結(jié)果與分析

3.1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

過硫酸氫鉀復(fù)合物粉影響因素試驗結(jié)果表明消毒劑在光照及高溫條件放置后，各指標未見明顯變化，但其吸濕性較強，在高濕試驗中樣品增重達10%，有效氯及氯化鈉含量均出現(xiàn)不同程度的下降，具體見表1。過硫酸氫鉀復(fù)合物粉加速試驗結(jié)果表明消毒劑在加速條件放置后各指標未見明顯變化，結(jié)果見表2。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明過硫酸氫鉀復(fù)合物粉高溫、光照試驗及加速試驗中，pH、干燥失重、氯化鈉、外觀性狀未發(fā)生變化，有效氯含量稍有降低，但含量變化在5%范圍內(nèi)，符合規(guī)定。另外，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉在高濕條件下發(fā)生了嚴重結(jié)塊現(xiàn)象，且各質(zhì)量指標出現(xiàn)顯著變化，所以應(yīng)選擇防潮性能較好的包材進行包裝。

3.3 消毒效果評價試驗

3.3.1 中和劑選擇試驗結(jié)果中和劑選擇試驗以大腸桿菌8099為指示菌，試驗中所用消毒劑的濃度為殺菌試驗中使用的最高濃度，即1∶100 稀釋，試驗結(jié)果見表3，由表3 數(shù)據(jù)可知0.5%硫代硫酸鈉可有效中和過硫酸氫鉀復(fù)合物粉及對照消毒劑的水溶液。

3.3.2 細菌定量試驗結(jié)果過硫酸氫鉀復(fù)合物粉及對照產(chǎn)品對大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌ATCC6538 的定量殺滅試驗結(jié)果見表4。由表中數(shù)據(jù)可知過硫酸氫鉀復(fù)合物粉及對照產(chǎn)品對兩種菌的有效殺菌濃度均為800 倍稀釋，過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對金黃色葡萄球菌ATCC6538 的殺菌效果略優(yōu)于市售進口產(chǎn)品。

表1 過硫酸氫鉀復(fù)合物粉影響因素試驗結(jié)果

表2 過硫酸氫鉀復(fù)合物粉加速試驗結(jié)果

表4 過硫酸氫鉀復(fù)合物粉及其對照產(chǎn)品對不同菌株的定量殺滅試驗結(jié)果

表3 中和劑選擇試驗結(jié)果

3.3.3 細菌定性試驗結(jié)果過硫酸氫鉀復(fù)合物粉及對照產(chǎn)品對大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌ATCC6538 的定性試驗結(jié)果見表5。由表中數(shù)據(jù)可知過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對及對照產(chǎn)品大腸桿菌8099 的最低有效濃度均為1,600 倍稀釋，該濃度的最短作用時間均為60min；過硫酸氫鉀復(fù)合物粉及對照產(chǎn)品對金黃色葡萄球菌ATCC6538 的最低有效濃度均為1,600 倍稀釋，該濃度的最短作用時間均為30min。

4 討論

過硫酸氫鉀復(fù)合物粉是一種高效、安全、環(huán)保、穩(wěn)定、持久的消毒劑，可有效殺滅9 種動物冠狀病毒。近期，在防控新型冠狀病毒肺炎疫情過程中，該消毒劑多次被緊急批準用于疫情的防控工作。該產(chǎn)品的質(zhì)量是否可靠直接關(guān)系到它能否在生物安全防控中發(fā)揮應(yīng)有的作用，因此開發(fā)質(zhì)量確切的產(chǎn)品對衛(wèi)生防范及生物安全防控具有重大意義。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示過硫酸氫鉀復(fù)合物粉吸濕性強，對濕度較敏感，在高濕度環(huán)境中會發(fā)生嚴重結(jié)塊，進而導(dǎo)致消毒劑有效成分快速下降，產(chǎn)品開發(fā)過程應(yīng)密切關(guān)注包材篩選工作，杜絕臨床使用中因包材問題引起產(chǎn)品質(zhì)量下降。

消毒效果試驗數(shù)據(jù)顯示過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌ATCC6538 均具有較好的殺滅作用。當(dāng)過硫酸氫鉀復(fù)合物粉800 倍稀釋時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的殺菌率均為100%，其殺菌效果略優(yōu)于市售進口產(chǎn)品，且優(yōu)于文獻[8-10]報道的研究結(jié)果，造成該結(jié)果的原因可能是由消毒劑制備工藝不同造成。

綜上所述，文中制備的過硫酸氫鉀復(fù)合物粉穩(wěn)定性較優(yōu)，對大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌ATCC6538 的殺菌效果與市售進口產(chǎn)品一致，后續(xù)可參考該試驗結(jié)果對產(chǎn)品的放大工藝參數(shù)進行研究，使產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)品與實驗室小試樣品的質(zhì)量及效果保持一致。█

表5 過硫酸氫鉀復(fù)合物粉對不同菌株的定性殺滅試驗結(jié)果