張坤煜，趙舒欣，王紅丁，賀蓓蓓,宋園亮

(湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442000 )

1 引言

豆豉是以黃豆或黑豆為主要原料，經霉菌或細菌等微生物發(fā)酵而成，它是我國一種傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，根據(jù)地域特點、地理氣候、飲食文化，不同地方又有不同的特色[1～3]。位于湖北省西北部的神農架自然保護區(qū)，其特殊的地理環(huán)境和氣候條件孕育了十分豐富的生物資源。神農架林區(qū)居住民族有10個，以漢族為主，林區(qū)部分居民有制作和食用大豆發(fā)酵食品的習慣，神農架豆豉是一種以大豆為主要原料，佐以花椒、生姜、大蒜和辣椒制成的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，有開胃生津、消積化滯、驅風散寒等功效，是神農架地區(qū)一種獨特風味佐餐食品。

目前，國內對神農架豆豉微生物種類鮮有報道，本研究從神農架林區(qū)采集的傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉樣品中分離微生物[4～7]，旨在了解該地區(qū)豆豉中微生物的種類及菌群分布情況，初步構建神農架林區(qū)微生物菌種庫，從中選育優(yōu)良菌株，為神農架豆豉的工業(yè)化發(fā)展做出貢獻。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

2.1.1 實驗材料

神農架豆豉樣品購于湖北省神農架林區(qū)松柏鎮(zhèn)集貿市場。

2.1.2 試劑

革蘭氏染色液試劑盒(Solarbio G1060)、香柏油(國藥集團化學試劑有限公司)、細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN DP302)、通用引物16S rDNA 27f和16S rDNA 1492r(Genscript)、10000×SolarGelRed核酸染料、2×Taq PCR MasterMix、M5 DL2000 DNA Marker MF025-01、瓊脂粉(杭州天和微生物試劑有限公司)。

2.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限責任公司)、MRS肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限責任公司)。

2.1.4 儀器與設備

NewClassic MF MS304S電子分析天平(梅特勒-托利多集團)、HCB-1300V垂直層流潔凈工作臺(Haier)、DHG-9243BS電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、THZ-82B氣浴恒溫振蕩器(常州市國旺儀器制造有限公司)、MLS-3781L高壓滅菌器(Panasonic公司)、SPH-2102C新穎立式小容量恒溫搖床(上海世平實驗設備有限公司)、BIO-RAD C1000 Touch PCR儀(美國伯樂公司)、Eppendorf Centrifuge 5424R小型冷凍高速離心機(德國艾本德股份公司)、OLYMPUS BX53顯微鏡、BIO-RAD Universal Hood Ⅱ凝膠成像分析儀(美國伯樂公司)、MK-2O干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)。

2.2 試驗方法

2.2.1 神農架豆豉樣品中微生物的分離

采用濃度梯度稀釋法分離豆豉樣品中的微生物。取1 g神農架豆豉樣品于試管中，加入9 mL 0.9% 滅菌生理鹽水，取滅菌的玻璃棒搗碎樣品并搖勻，靜置30 min。從試管中取1 mL 液體加入 9 mL 0.9% 滅菌生理鹽水中，以此類推，配制成8個稀釋濃度。

2.2.2 神農架豆豉樣品中微生物的純化

取稀釋濃度為 10-8～10-4的樣品各100 μL，用玻璃三角涂布棒均勻涂布在MRS培養(yǎng)基平板上，直至干燥。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內，倒置培養(yǎng)24 h。選取形態(tài)不同的單菌落共7個，挑取菌落，采用平板劃線法純化菌株并進行編號[8～10]，分別編號為SN1-1、SN1-2、SN1-3、SN1-4、SN1-5、SN1-6、SN1-7。

37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，在超凈臺內，每個平板上選取1個生長情況較好的單菌落，分別用鑷子夾取滅菌200 μL槍頭挑取菌落，放入有3 mL MRS肉湯培養(yǎng)基的離心管中。另取一只離心管加入3 mL MRS肉湯培養(yǎng)基、滅菌200 μL槍頭做空白對照，8只離心管恒溫搖床37 ℃ 150 r/min震蕩過夜。

2.2.3 菌株的革蘭氏染色

2.2.3.1 菌株革蘭氏染色

標號為SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5出現(xiàn)明顯渾濁。取4塊載玻片做好正反面標記，分別取1環(huán)菌液滴在載玻片中央，在酒精燈火焰上方烘干，并在火焰中來回1～2次固定。加結晶紫染色1 min，水洗；加碘液染色1 min，水洗；加95%酒精，脫色30 s，水洗，吸去水分；加蕃紅染色1 min，水洗，晾干。

2.2.3.2 菌株革蘭氏染色鏡檢

滴1滴香柏油，油鏡鏡檢。

2.2.4 菌株的DNA鑒定

使用細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)提取四株菌株的基因組DNA。PCR擴增采用16S rDNA 通用引物，正向引物27f序列為 5＇-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3＇，反向引物1492r 序列為5＇-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3＇，擴增長度為1500 bp 左右，聚合酶鏈式反應( PCR) 擴增體系見表1。

表1 PCR擴增體系(20 μL)

PCR反應條件：95 ℃預變性 3 min;95 ℃變性30 s，56 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 2 min，此階段循環(huán)30次，72 ℃ 延伸 5 min，擴增產物4 ℃ 保存。

SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

2.2.5 構建系統(tǒng)發(fā)育樹

將獲得的SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5菌株的16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站上用BLAST序列對比程序中的Nucleotide BLAST在數(shù)據(jù)庫中進行比較，分析同源性，選取8個與菌株同源較高的16S rDNA 序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用MEGA5.0軟件[11],以Neighbor-joining法繪制16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹[12，13]。

3 結果與分析

3.1 菌株的革蘭氏染色

鏡檢照片如圖1，革蘭氏染色結果及形態(tài)見表2。

表2 從神農架豆豉樣品中分離得到的四株菌的革蘭氏染色結果及形態(tài)

圖1 革蘭氏染色鏡檢照片(圖中右下角標尺均為50 μm，目鏡10倍，物鏡100倍)

所分離的4株菌株均為革蘭氏陽性菌，成鏈形，形狀為棒狀或桿狀。

3.2 菌株的DNA鑒定

對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳成像見圖2。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳成像

SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，通過序列結果拼接，得到SN1-1菌株16S rDNA 序列長度為1455bp，SN1-3、SN1-4、SN1-5菌株16S rDNA 序列長度均為1451bp。

3.3 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

將SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5菌株的DNA序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，采用MEGA5.0軟件，以Neighbor-joining法繪制的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹[14～17]如圖3～6。

據(jù)圖3～6分析可知，菌株SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5與芽孢桿菌(Bacillus sp.)系統(tǒng)位置最近。根據(jù)16SrDNA序列同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，可以得到菌株SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5屬于細菌范疇，為芽孢桿菌屬，是枯草芽孢桿菌屬的亞種。

圖4 利用16SrDNA序列對SN1-3菌株進行構建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 利用16SrDNA序列對SN1-4菌株進行構建系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 利用16SrDNA序列對SN1-5菌株進行構建系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

神農架屬大巴山脈東延之余脈，地勢由南向北，由西向東逐漸降低，形成了典型的垂直生態(tài)系統(tǒng)和植被類型。神農架地區(qū)屬亞熱帶季風氣候，主要受亞熱帶季風氣候的影響，溫度適宜，降水豐沛。其特殊的地理位置和氣候環(huán)境造成了獨特的微生物種群。神農架林區(qū)豆豉的微生物資源豐富，由于人們對其營養(yǎng)價值認識不足，食用人群相對偏少，目前還未有學者對神農架豆豉中微生物開展研究。本研究以神農架林區(qū)豆豉為研究對象，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和分子鑒定方法相結合，對分離的神農架豆豉中的細菌進行鑒定。相比較傳統(tǒng)的生理生化鑒定，具有簡潔快速、準確性高的優(yōu)點。

本研究從神農架林區(qū)3個豆豉樣品中分離篩選出了4株菌株，并對其進行了形態(tài)學和分子生物學鑒定，將其鑒定為枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌是細菌型豆豉發(fā)酵的主要微生物，因其具有豐富的酶系，能分泌產生蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等十幾種酶，與豆豉風味、品質、色澤等密切相關。對于神農架林區(qū)細菌型豆豉優(yōu)勢菌株的篩選與鑒定，本試驗采集了3個豆豉樣品，未分離出乳酸菌，且分子鑒定數(shù)量相對較少。下一步，將采集較多的豆豉樣品，進行微生物多樣性鑒定，探究神農架林區(qū)豆豉的種類組成，并將篩選的優(yōu)勢菌株進行純菌種發(fā)酵研究，進而為神農架豆豉工業(yè)化、標準化生產提供參考。