常海瑤 劉晶 吳文昊 牛樂樂 李興

1山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001; 2山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，太原 030009

糖尿病腎病(DN)是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎臟疾病的最主要病因[1]。糖代謝紊亂、高血壓、高血脂、年齡等均是DN的危險因素[2]。DN發(fā)生的分子機(jī)制可能為高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、增加Ⅳ型膠原纖維和纖維連接蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致腎小球硬化和間質(zhì)損傷，但具體機(jī)制仍不清楚[3]。血管生成素樣蛋白6(ANGPTL6)主要在肝臟、脂肪組織中表達(dá)，可抑制肝細(xì)胞中的糖異生，此外，ANGPTL6可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致微血管缺血、缺氧的發(fā)生[4-5]。瘦素是由脂肪細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡的多肽類激素，在促進(jìn)腎臟病理生理變化中有直接作用[6-7]。有研究顯示，瘦素可調(diào)節(jié)血清ANGPTL6的表達(dá)[8]。因此，ANGPTL6與瘦素可能起協(xié)同作用，并與DN相關(guān)。

1 對象與方法

1.1 研究對象與分組 選取2018年12月—2019年12月在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科住院治療的2型糖尿病患者97例，根據(jù)尿白蛋白排泄率(UAER)分為兩組：單純2型糖尿病組50例(UAER<30 mg/24 h)，男34例，女16例，平均年齡為(54.46±13.02)歲，平均病程為(3.37±5.89)年；DN組47例(UAER≥30 mg/24 h)，男27例，女20例，平均年齡為(60.47±13.87)歲，平均病程為(9.56±22.49)年；同時選取該院同期58名體檢正常者作為對照組，其中男32名，女26名，平均年齡為(46.26±12.87)歲。2型糖尿病根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。DN組：收集的患者數(shù)據(jù)中并無活動性尿沉渣異常，無短期內(nèi)估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)迅速下降、短期內(nèi)UAER迅速升高或腎病綜合征，故未行腎臟穿刺，故根據(jù)UAER升高而做出臨床診斷。糖尿病組治療情況：住院期間平均空腹血糖水平(6.78～10.54 mmol/L),合并高血壓者服用降壓藥(氯沙坦鉀片)后監(jiān)測血壓波動于129/76～154/94 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，合并高脂血癥者給予降脂藥(阿托伐他汀鈣片)，期間未復(fù)查血脂，未隨訪；DN組治療情況：住院期間平均空腹血糖水平8.56～15.46 mmol/L，合并高血壓者服用降壓藥(氯沙坦鉀片聯(lián)合苯磺酸左旋氨氯地平片)后監(jiān)測血壓波動于148/98～167/108 mmHg，合并高脂血癥者給予降脂藥(阿托伐他汀鈣片)，期間未復(fù)查血脂，未隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)糖尿病急性并發(fā)癥。(2)1型糖尿病及其他類型糖尿病患者。(3)尿路感染及其他嚴(yán)重感染者。(4)痛風(fēng)。(5)合并其他系統(tǒng)疾病等。(6)除外影響尿蛋白的各種生理病理疾病。(7)合并原發(fā)性、繼發(fā)性腎臟疾病及藥物導(dǎo)致的UAER升高。本研究獲得山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本留取及生化指標(biāo)測定 所有研究對象空腹8 h，次日晨7：00抽取靜脈血，離心、分離血清后80℃冰箱儲存，用于測定血清ANGPTL6、瘦素水平；同時抽取靜脈血用于測定空腹血糖、HbA1c、空腹胰島素(FINS)、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)等指標(biāo)；留取尿標(biāo)本，測定尿微量白蛋白及尿肌酐值；穩(wěn)態(tài)模型評估-胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖×FINS/22.5；同時進(jìn)行身高、體重的測量，并計算體重指數(shù)=體重/身高2(m2)。

1.2.2 ANGPTL6、瘦素水平的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清ANGPTL6、瘦素水平。過程如下：實(shí)驗(yàn)前標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及樣本準(zhǔn)備；加樣(標(biāo)準(zhǔn)品或樣本)100 μl，37℃孵育60 min，不洗；甩干，加檢測溶液A 100 μl，37℃孵育60 min；重復(fù)洗板3次；加檢測溶液B 100 μl，37℃孵育30 min；洗板5次；加TMB底物90 μl，37℃反應(yīng)10～20 min；加終止液50 μl，用酶標(biāo)儀在450 nm測定OD值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD值帶入方程，求出樣品濃度(ANGPTL6的檢測范圍：3.12～200 μg/L，瘦素檢測范圍：0.156～10 μg/L)，試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司。

表1 3組間一般資料及生化指標(biāo)的比較

2 結(jié)果

2.1 各組間一般資料及生化指標(biāo)的比較 各組間性別、體重指數(shù)、舒張壓、LDL-C、HDL-C、總膽固醇、甘油三酯比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。單純2型糖尿病組年齡、空腹血糖、FINS、HOMA-IR、HbA1c均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。DN組收縮壓、ANGPTL6、瘦素均高于對照組(P均<0.05)。DN組年齡、空腹血糖、FINS、HOMA-IR、HbA1c均高于單純2型糖尿病組(P均<0.05)，見表1。

2.2 ANGPTL6、瘦素水平與各指標(biāo)的相關(guān)性分析 分別以ANGPTL6、瘦素為因變量，與其他臨床指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。AFNGPTL6與年齡、收縮壓、HOMA-IR、HbA1c、UAER、瘦素呈正相關(guān)(P均<0.05)。瘦素與年齡、體重指數(shù)、收縮壓、HOMA-IR、HbA1c、UAER、ANGPTL6呈正相關(guān)(P均<0.05)，見表2。

表2 ANGPTL6、瘦素水平與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 UAER影響因素的多元線性回歸分析 以UAER為自變量，空腹血糖、FINS、收縮壓、HbA1c、HOMA-IR、ANGPTL6、瘦素為因變量進(jìn)行多元線性回歸分析，經(jīng)過變量篩選后結(jié)果示空腹血糖、ANGPTL6、瘦素為DN的危險因素，見表3。

表3 UAER影響因素的多元線性回歸分析

3 討論

據(jù)2017年國際糖尿病聯(lián)盟公布的數(shù)據(jù)顯示，中國2型糖尿病患者2045年將達(dá)1.2億，位居世界第一[9]。其中，DN為最常見的微血管并發(fā)癥。研究認(rèn)為糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、纖維化及細(xì)胞因子等多因素參與了DN的發(fā)病環(huán)節(jié)[10]。然而，在疾病早期DN患者的臨床表現(xiàn)常不明顯，直至發(fā)展為大量白蛋白尿才引起重視，此時腎功能嚴(yán)重受損，最終需靠透析來維持生命，造成沉重的財政和保健負(fù)擔(dān)。因此，尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物輔助提高DN患者的發(fā)現(xiàn)率、診斷率刻不容緩。

瘦素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種多肽類激素，參與機(jī)體能量代謝[6]。瘦素主要經(jīng)腎臟代謝，研究發(fā)現(xiàn)，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞可表達(dá)高親和力的瘦素受體，瘦素與其受體結(jié)合可誘導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生，被認(rèn)為在腎臟病理生理變化中有直接作用[7]。本研究結(jié)果顯示，DN組瘦素水平顯著升高，且與UAER呈正相關(guān)，可能的機(jī)制為瘦素與其受體結(jié)合，使腎小球內(nèi)皮功能紊亂，增加腎小球內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達(dá)，刺激系膜細(xì)胞Ⅰ型膠原纖維和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞Ⅳ型膠原纖維的合成，使內(nèi)皮細(xì)胞受損；同時瘦素可激活腎小球內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)，促使腎小球肥大，腎小球?yàn)V過率下降，加速尿白蛋白排泄，共同參與了DN的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。

ANGPTL6主要在調(diào)節(jié)糖脂代謝、胰島素抵抗、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷等方面發(fā)揮作用[5，13]。體外實(shí)驗(yàn)表明，ANGPTL6通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2-內(nèi)皮型一氧化氮合酶信號通路，增加一氧化氮的產(chǎn)生，誘導(dǎo)小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)皮細(xì)胞損傷后通過分泌炎性介質(zhì)和單核細(xì)胞趨化蛋白誘發(fā)炎性反應(yīng)，參與DN的發(fā)生、發(fā)展[5]。ANGPTL2、ANGPTL4、ANGPTL6均屬血管生成素樣蛋白家族，在糖脂代謝方面起協(xié)同作用。最新研究表明，ANGPTL2、ANGPTL4通過不同途徑參與DN的發(fā)展。有證據(jù)支持轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB在系膜細(xì)胞中的基本作用參與了DN進(jìn)展[14-15]。ANGPTL4基因敲除小鼠通過抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞中核因子-κB的產(chǎn)生，降低了腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6的產(chǎn)生，延緩DN的進(jìn)程[16]。據(jù)報道ANGPTL-4在DN大鼠腎組織中表達(dá)上調(diào)，其水平與尿白蛋白、肌酐呈正相關(guān)[17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4(TLR4)通過炎性反應(yīng)、纖維化途徑與DN的發(fā)展密切相關(guān)[18]。Yang等[19]研究表明，DN大鼠中ANGPTL2和TLR4的表達(dá)上調(diào)，而ANGPTL2基因敲除大鼠TLR4受到抑制，大鼠腎損傷、炎性反應(yīng)、腎纖維化和系膜外基質(zhì)積累得到緩解。Morinaga等[20]也證明了小鼠體內(nèi)缺乏ANGPTL2可以通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1信號通路來減輕腎間質(zhì)組織損傷。本研究表明，DN組ANGPTL6水平較對照組升高，多元線性回歸分析顯示ANGPTL6是DN的危險因素。鑒于ANGPTL6與DN的研究較少，ANGPTL6可能通過上述促炎途徑、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、纖維化等機(jī)制促進(jìn)DN的發(fā)生，但尚需大量研究證實(shí)。

研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL6基因敲除小鼠在正常飲食下也會出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗，表現(xiàn)為血清膽固醇和游離脂肪酸水平顯著升高，骨骼肌和肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)積累[4]。研究表明，脂蛋白在腎間質(zhì)中積累可通過多元醇途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞聚集及促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，增加血液黏度，引起腎血管缺氧，加速DN的發(fā)展[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL6與HOMA-IR呈正相關(guān)，多元線性回歸分析顯示HOMA-IR為UAER的影響因素，推測ANGPTL6通過影響胰島素敏感性，促進(jìn)DN的進(jìn)展。另外，ANGPTL6與LDL-C、HDL-C、甘油三酯、總膽固醇無關(guān)，可能與樣本量小、口服降脂藥物等因素有關(guān)，尚需大樣本研究明確ANGPTL是否通過調(diào)節(jié)血脂影響DN的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ANGPTL6與瘦素水平呈正相關(guān)。研究顯示高劑量瘦素處理小鼠原代肝細(xì)胞，導(dǎo)致ANGPTL6基因、蛋白質(zhì)水平上調(diào)[8]。因此，ANGPTL6的表達(dá)可能直接依賴于肝臟瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但具體機(jī)制仍不清楚。ANGPTL6、瘦素可能均與炎性反應(yīng)、纖維化有關(guān)，通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、系膜細(xì)胞基質(zhì)沉積等，在DN的發(fā)展中起協(xié)同作用。綜上所述，DN患者血清ANGPTL6、瘦素水平升高，且二者為DN的危險因素。同時，瘦素可能影響DN患者的ANGPTL6水平，ANGPTL6、瘦素可能成為DN診斷和治療新的靶點(diǎn)，但相關(guān)機(jī)制仍需大量研究證實(shí)。