林 琳,陳文慶,方厚智,高 杰,崔海英

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

大腸桿菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)為一種腸道病原體,可引發(fā)多種嚴重疾病,相關研究表明,一些果蔬易被大腸桿菌O157∶H7污染,且能在各種食品加工材料表面以及果蔬表面形成生物膜,威脅食用者健康[1-3]。生物膜是細菌利用其自身分泌的多糖類基質(zhì),將細菌小菌落連接到惰性表面,同時將其它碎屑,包括營養(yǎng)物質(zhì)和細菌也截留在其中,最終形成一層堅固的薄膜,難以清除。傳統(tǒng)的化學殺菌雖能在一定程度上滅菌,但同時也破壞了果蔬內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì),且果蔬表面會有化學試劑殘留,不能達到保證果蔬感官品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)的同時有效殺滅細菌的目的[4]。

目前,等離子體處理作為一種物理殺菌保鮮技術,已被歐美等發(fā)達國家所普遍接受[5-8]。其中,冷等離子體不僅能夠殺死果蔬表面的致病微生物[9-12],還可以降解農(nóng)藥殘留,且無次生污染物,十分符合果蔬采后貯藏保鮮的需要[13-14]。大氣壓冷等離子體(atmospheric cold plasma,ACP)是等離子體家族的新秀,是在一個大氣壓條件下通過給被介質(zhì)隔開的電極施加高能量產(chǎn)生[15-16]。由于ACP是在大氣壓條件下產(chǎn)生,不需昂貴的真空設備和復雜耗時的操作程序,與傳統(tǒng)的低氣壓等離子體技術相比可降低成本,提高殺菌效率,具有明顯的優(yōu)勢[17-19]。任翠榮等[20]研究了ACP處理對草莓保鮮效果的影響,結(jié)果表明在140 V下處理60 s時,草莓的保鮮效果最好;張志偉[21]研究了ACP對鮮切胡蘿卜表面金黃色葡萄球菌的殺菌效果及品質(zhì)影響,結(jié)果表明在170 V下,處理5 min時,殺菌率達到92.35%,同時保持了胡蘿卜的理化品質(zhì);Misra等[22]研究了ACP處理對草莓表面微生物的滅活作用,發(fā)現(xiàn)ACP處理5 min后,在未影響草莓感官品質(zhì)的同時,草莓表面菌落數(shù)減少了兩個數(shù)量級。但目前國內(nèi)外對ACP冷殺菌技術在果蔬表面生物膜的清除及其抗菌機制方面研究甚少。

本文探究了ACP清除E.coliO157∶H7生物膜的最佳處理功率和處理時間,觀察了E.coliO157∶H7生物膜在ACP處理前和處理后的形態(tài)變化,同時研究了ACP處理對E.coliO157∶H7生物膜的抗菌機制,最后以戶太葡萄、圣女果、維多利亞青提、生菜為研究對象,將ACP處理應用到這四種果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的清除,以期探究ACP的抗菌機制及應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coliO157∶H7(CICC 21530) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(Trypticase soy broth medium,TSB) 杭州微生物試劑有限公司;魚粉蛋白胨、瓊脂 青島海博生物科技有限公司;牛肉浸膏 北京奧博星有限公司;氯化鈉、無水磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鈉、硫酸、氯仿 國藥集團化學試劑有限公司;苯酚、異戊醇、乙醇、醋酸鈉 上海阿拉丁有限公司;新鮮戶太葡萄、維多利亞青提、圣女果、生菜 購于江蘇大學凱源超市。

APLM-SP-YB-D1KW-3232328-2-5大氣壓冷等離子體裝置 南京愛特維電子科技有限公司;TGL-16K高速冷凍離心機 湖南湘儀有限公司;Scizntz-D超聲波細胞破碎儀 寧波新芝有限公司;Infinite 200 PRO酶標儀 瑞士Tecan公司;UV2550紫外分光光度計 日本島津公司;Color Quest XE分光測色儀 美國HunterLab公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ACP處理對E.coliO157∶H7生物膜的清除作用測定 將無菌不銹鋼片(2 cm×2 cm)加入到接有E.coliO157∶H7菌液(105～106CFU/mL)的TSB培養(yǎng)基中,25 ℃下培養(yǎng)5 d,期間每天更換一次滅過菌的TSB培養(yǎng)基,5 d后將不銹鋼片取出至無菌培養(yǎng)皿中,用無菌PBS浸泡清洗30 min,以除去游離的E.coliO157∶H7。然后送至大氣壓冷等離子體裝置的載物臺進行ACP處理,控制處理時間為2 min,處理功率分別為0、200、300、400、500、600 W以確定最佳處理功率;控制處理功率為400 W,處理時間分別為0、1、2、3、4、5 min以確定最佳處理時間,未經(jīng)ACP處理的不銹鋼片作為空白。處理結(jié)束后將不銹鋼片置于含有20 mL無菌PBS的離心管中,超聲10 min以使不銹鋼片表面的生物膜分離形成浮游細菌。然后將所得菌懸液十倍梯度稀釋,涂布于NA瓊脂培養(yǎng)基,24 h后測定殘存菌數(shù)[23]。ACP處理對E.coliO157∶H7生物膜的清除率的計算公式:

1.2.2 場發(fā)射掃描電鏡觀察E.coliO157∶H7生物膜 將尼龍片(1 cm×1 cm)用無水乙醇浸泡,超聲清洗4 h,121 ℃滅菌30 min。將無菌尼龍片加入接有E.coliO157∶H7菌液(105～106CFU/mL)的TSB培養(yǎng)基中,25 ℃下培養(yǎng)5 d,期間每隔24 h用移液槍吸走全部TSB培養(yǎng)基,并加入等量全新的滅過菌的TSB培養(yǎng)基,5 d后將不銹鋼片取出,用無菌PBS清洗三次后晾干,隨后用ACP處理,未經(jīng)ACP處理的尼龍片作為空白。最后用場發(fā)射掃描電鏡觀察處理組與空白組的生物膜變化情況[23]。

1.2.3 ACP處理對E.coliO157∶H7生物膜的抑制機制研究 胞外聚合物中多糖、蛋白質(zhì)及DNA含量測定參考柏梅[24]山蒼子精油對胞外聚合物中多糖、蛋白質(zhì)及DNA影響的實驗方法,將山蒼子精油處理改為ACP處理。

1.2.4 ACP處理對四種果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的清除作用評價 取約大小為1 cm×1 cm的葡萄皮浸泡在100 ppm的次氯酸鈉溶液中,超聲1 h后,置于超凈臺中,紫外滅菌1 h以除去葡萄皮表面原有微生物,然后將葡萄皮加入到接有E.coliO157∶H7菌液(105～106CFU/mL)的TSB培養(yǎng)基中,25 ℃下培養(yǎng)3 d,期間每隔24 h用移液槍吸走全部TSB培養(yǎng)基,并加入等量全新的滅過菌的TSB培養(yǎng)基,3 d后將葡萄皮取出至無菌培養(yǎng)皿中,用無菌PBS浸泡清洗30 min,以除去游離的E.coliO157∶H7。待葡萄皮自然晾干后,取六片葡萄皮在最佳處理功率和處理時間條件下進行ACP處理,每次只處理一片葡萄皮,未經(jīng)ACP處理的葡萄皮作為空白。

表1 葡萄感官評分表Table 1 Sensory evaluation standards of grape

取其中一片處理組葡萄皮和空白組葡萄皮置于兩個盛有PBS的無菌均質(zhì)袋中,拍打式均質(zhì)器均質(zhì)15～20 s,制成1∶5的樣品勻液,將所得樣品勻液十倍梯度稀釋,涂布于NA瓊脂培養(yǎng)基,24 h后測定殘存菌數(shù)。剩下五片處理組葡萄皮和五片空白組葡萄皮于12 ℃下貯藏,分別待1、2、3、4、5 d后按上述步驟均質(zhì)、稀釋、涂布、計數(shù)。另取12片培養(yǎng)有E.coliO157∶H7生物膜的葡萄皮均分為兩組,按上述步驟進行兩次重復實驗。取新鮮的圣女果、維多利亞青提和生菜作為測試果蔬,按上述步驟處理樣品以評價ACP處理對其表面E.coliO157∶H7生物膜的清除作用[25]。

1.2.5 色澤測定 由于購買來的整粒葡萄顏色深淺不一,測色澤時會產(chǎn)生較大誤差,取顏色深淺較為均一的半粒葡萄作為測試樣品,在相同部位進行ACP處理,處理結(jié)束后立即采用分光測色儀分析表面顏色變化,得出L*、a*、b*值,未經(jīng)ACP處理的葡萄作為空白組。

1.2.6 感官評定 在江蘇大學隨機選取30位師生對空白組和處理組的葡萄的感官性能(外觀、顏色、味道、總體接受性)作出評價打分,1～9分代表喜歡的不同程度[26]。另取新鮮的圣女果、維多利亞青提和生菜作為測試果蔬,按上述步驟評價各個果蔬的感官性能。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復三次,實驗結(jié)果采用平均值±標準誤差的形式,使用SPSS軟件(IBM 21.0版本)中的單因素方差分析對空白組和實驗組進行顯著性分析(P<0.05表明有顯著性差異,圖中用*表示),Origin 8.5軟件進行分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACP處理對E. coli O157∶H7生物膜的清除作用

2.1.1 ACP最佳處理功率的確定 如圖1所示,未經(jīng)ACP處理的不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)為1.05×105CFU/cm2,隨著處理功率增加至400 W,不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)逐漸降至3.50×103CFU/cm2,與未經(jīng)ACP處理的不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)相比差異顯著(P<0.05)。繼續(xù)增加處理功率,活菌數(shù)逐漸回升至6.55×104CFU/cm2,由此可見,在處理功率為400 W條件下,不銹鋼片表面生物膜殘存活菌數(shù)最低,對應的生物膜清除率達到最高,可清除97.66%±0.28%的E.coliO157∶H7?？赡苁且驗樵诖斯β氏吕涞入x子體釋放出的自由基、離子、受激分子等活性粒子作用于生物膜,使細胞膜通透性增加,導致胞內(nèi)物質(zhì)大量泄漏,促使細胞凋亡[20-21];另外冷等離子體釋放出的活性粒子可能也會降低胞外聚合物中多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的含量,導致生物膜被離散、瓦解。因此選擇400 W作為ACP的最佳處理功率。

圖1 ACP最佳處理功率的確定Fig.1 Determination of optimal ACP processing power注:*表示與空白相比,差異顯著(P<0.05)。圖2、圖4、圖5同。

2.1.2 ACP最佳處理時間的確定 如圖2所示,未經(jīng)ACP處理的不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)約為1.23×106CFU/cm2,隨著處理時間增加至3 min,不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)逐漸降至3.02×103CFU/cm2,與未經(jīng)ACP處理的不銹鋼片表面生物膜活菌數(shù)相比差異顯著(P<0.05)。繼續(xù)增加處理時間至4 min,活菌數(shù)回升至1.78×104CFU/cm2,當處理時間為5 min時,活菌數(shù)回落至7.08×103CFU/cm2,由此可見,處理時間在3、4、5 min時,殘存活菌數(shù)穩(wěn)定在104CFU/cm2上下,在處理時間為3 min條件下,不銹鋼片表面生物膜殘存活菌數(shù)最低,對應的生物膜清除率達到最高,可清除99.75%±0.25%的E.coliO157∶H7,因此,選擇3 min作為ACP的最佳處理時間。

圖2 ACP最佳處理時間的確定Fig.2 Determination of optimal ACP processing time

圖4 ACP處理后E. coli O157∶H7生物膜胞外物質(zhì)游離程度變化Fig.4 Changes of biofilm extracellular materials after ACP treatment注:A:胞外聚合物中多糖含量變化;B:胞外聚合物中蛋白質(zhì)含量變化;C:胞外聚合物中DNA含量變化。

2.2 場發(fā)射掃描電鏡觀察生物膜

圖5 ACP處理對四種果蔬表面E. coli O157∶H7生物膜的清除作用評價Fig.5 Evaluation of clearance effect of ACP treatment on E. coli O157∶H7 biofilms on the surface of four fruits and vegetables注:A:戶太葡萄;B:圣女果;C:維多利亞青提;D:生菜。

如圖3所示,在場發(fā)射掃描電鏡下,樣品被放大至30000倍后,空白組中E.coliO157∶H7飽滿光滑,大部分E.coliO157∶H7相互聚集在一起,黏附在尼龍片表面,形成致密的生物膜,只有極少數(shù)的游離細菌存在;經(jīng)ACP處理后,已經(jīng)觀察不到致密的大范圍的生物膜結(jié)構(gòu),大部分的E.coliO157∶H7以游離的方式分散開來,且部分E.coliO157∶H7內(nèi)容物滲出,處于失活狀態(tài),E.coliO157∶H7生物膜基本被破壞,ACP處理達到了較佳的清除效果。

圖3 場發(fā)射掃描電鏡觀察E. coli O157∶H7生物膜(30000×)Fig.3 Scanning electron microscope images ofE. coli O157∶H7 biofilms(30000×)注:A:空白組;B:處理組。

2.3 ACP處理對E. coli O157∶H7生物膜的抑制機制

胞外聚合物中多糖在細菌生物膜形成過程中可通過靜電作用將細菌黏附在一起,由圖4A可知,與空白組相比,經(jīng)ACP處理后,E.coliO157∶H7的胞外聚合物中多糖含量顯著降低(P<0.05)。ACP處理可抑制胞外聚合物中多糖的合成與分泌,從而抑制生物膜的形成。另外圖4B反映了胞外聚合物中蛋白質(zhì)含量相對空白組也顯著降低(P<0.05),這也說明ACP處理可抑制E. coli O157∶H7胞外聚合物中蛋白質(zhì)的合成與分泌,但ACP處理并沒有影響胞外聚合物中DNA的含量,圖4C中空白組與處理組的胞外聚合物中DNA含量差異不顯著。

2.4 ACP處理對四種果蔬表面E. coli O157∶H7生物膜的清除作用評價

表2 ACP處理對四種果蔬色澤和感官品質(zhì)的影響Table 2 Effects of ACP treatment on color and sensory quality of four kinds of fruits and vegetables

圖5結(jié)果顯示,與空白組相比,在400 W下經(jīng)ACP處理3 min后的四種果蔬表面生物膜中殘存活菌數(shù)均大大降低,在處理當天,戶太葡萄、圣女果、維多利亞青提及生菜表面殘存活菌數(shù)分別降低了98.99%±0.38%、99.92%±0.20%、96.84%±0.18%、99.80%±0.23%。戶太葡萄與維多利亞青提的表面殘存活菌數(shù)于ACP處理后2 d達到最低,圣女果表面的殘存活菌數(shù)則在1 d后即達到最低,之后殘存活菌數(shù)均先緩慢上升后緩慢下降,而生菜在ACP處理完后的2 d內(nèi)殘存活菌數(shù)緩慢上升,之后緩慢下降,但5 d內(nèi)四種果蔬表面的殘存活菌數(shù)仍在抑制范圍內(nèi)。四種果蔬表面的殘存活菌數(shù)第二次下降的原因可能是果蔬表皮的營養(yǎng)已經(jīng)不足,無法滿足E.coliO157∶H7的生長、代謝活動,導致殘存活菌數(shù)再次降低。另外,不同果蔬表面殘存的活菌數(shù)不同可能是因為果蔬表面的粗糙度不同,造成了E.coliO157∶H7生物膜形成的差異,其中,生菜表面殘存活菌數(shù)最多,由此可見,生菜表面較易適合E.coliO157∶H7生物膜的形成,這可能與生菜表面密集的氣孔有關。綜合四種果蔬空白組與處理組表面的殘存菌數(shù)變化來看,ACP處理可在1～2 d內(nèi)使戶太葡萄、圣女果、維多利亞青提表面殘存活菌數(shù)降至最低,而生菜在處理當天表面殘存活菌數(shù)達到最低,但在5 d內(nèi)四種果蔬表面殘存活菌數(shù)均在抑制范圍內(nèi),達到了較佳的生物膜清除效果,延長了果蔬的貯藏期。

2.5 色澤測定和感官評定

由表2可知,在400 W的功率下,采用ACP處理3 min后,戶太葡萄的a*值有所上升,L*值、b*值略微降低,表明ACP處理后,戶太葡萄色澤略微不如新鮮的戶太葡萄,但影響不大;圣女果的L*值基本維持不變,a*值和b*值均有較大上升,表明ACP處理略微加深了圣女果的色澤;維多利亞青提的L*值和b*值有明顯下降,但a*值略微上升,表明ACP處理略微減淡了維多利亞青提的色澤;生菜的L*值和a*值略微下降,但b*值略微上升,表明ACP處理略微減淡了維多利亞青提的色澤。另外,四種果蔬的外觀、顏色、味道雖有所變化,但總體上也能被接受。綜上所述,ACP處理雖對四種果蔬的色澤和感官品質(zhì)略有影響,但仍能被大家所接受。

3 結(jié)論

大氣壓等離子體處理對E.coliO157∶H7生物膜表現(xiàn)出了較好的清除作用。在最佳處理功率400 W,最佳處理時間3 min條件下,ACP通過抑制胞外聚合物中多糖及蛋白質(zhì)的合成與分泌來抑制生物膜的形成,表現(xiàn)出了最佳的清除效果;另外,通過場發(fā)射掃描電鏡也能觀察到在經(jīng)ACP處理后E.coliO157∶H7生物膜大幅度被清除,大部分E.coliO157∶H7由聚集狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x狀態(tài)。當ACP應用于戶太葡萄、圣女果、維多利亞青提及生菜這四種果蔬表面的E.coliO157∶H7生物膜的清除時,在處理當天及在5 d內(nèi)表現(xiàn)出了明顯的抑制效果,延長了四種果蔬的貯藏期。同時,感官評定結(jié)果表明,ACP處理基本不影響四種果蔬的感官品質(zhì),加之ACP是在大氣壓條件下產(chǎn)生,不需昂貴的真空設備和復雜耗時的操作程序,因此,在果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的清除過程中,可以引進ACP處理,以減少果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的污染,提高果蔬的食用安全性。另外,可以進一步研究ACP處理對其他細菌生物膜的清除效果及機制,為ACP處理更廣闊的應用在果蔬貯藏保鮮領域奠定理論基礎。