李世闖,蔡 帥,郭秋爽,張銘楷,李 華,劉宇鵬

(河南大學生命科學學院微生物工程研究所,河南開封 475004)

雄烯二酮是一類內(nèi)源性類固醇激素,可由人體性腺及腎上腺分泌,是體內(nèi)雄性激素合成途徑中睪酮的直接前體,也是雌性激素合成途徑中雌激素的前體。它在合理控制雄激素和雌激素的平衡中起到至關重要的作用[1-2]。雄烯二酮可調(diào)節(jié)男性體內(nèi)的睪酮含量,使得男性雄激素的含量增加,從而使得性能力增加。雄烯二酮能夠?qū)⒙殉箔h(huán)境中的雄激素水平提高到正常范圍,從而促進卵巢內(nèi)卵泡的生長并且修復卵巢組織,增加妊娠的機率。另外,雄烯二酮還是甾體藥物合成的重要中間體,通過雄烯二酮幾乎可以合成所有的甾體藥物[3-4]。

目前我國生產(chǎn)雄烯二酮主要是從野生中藥材“穿地龍”等植物中提取薯蕷皂素經(jīng)化學合成而成,不僅工藝復雜、消耗成本高,而且污染環(huán)境。自從Sih等發(fā)現(xiàn)利用微生物可以切除甾醇的飽和側(cè)鏈后,以自然界的動植物甾醇為原料生產(chǎn)甾體類藥物的研究進展迅速。姜紹通等[5]進行了兩相系統(tǒng)轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄烯二酮的研究,結(jié)果表明,當有機相為大豆油,有機相所占比例為22%,發(fā)酵7 d,投料量為4 g/L時,植物甾醇的轉(zhuǎn)化率最高,達到85.7%。但是底物濃度太低,發(fā)酵時間長、易染菌,同時含有有機相,分離提取比較困難。王艷婷[6]利用雙水相體系進行了降解植物甾醇側(cè)鏈和制備雄烯二酮的研究,在吐溫40添加量1%(V/V)、轉(zhuǎn)速240 r/min的條件下,植物甾醇投料濃度提高到10 g/L,發(fā)酵96 h后雄烯二酮的濃度達到1.1 g/L。傳統(tǒng)發(fā)酵方法生產(chǎn)雄烯二酮主要的限制因素是植物甾醇不溶于水,導致轉(zhuǎn)化率低,同時提取也比較麻煩。游離細胞法比傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)有不怕染菌、反應時間短、反應條件溫和、分離提取簡單等優(yōu)點[7-8]。王志龍等利用游離細胞法在濁點體系中降解植物甾醇生成雄二烯二酮[9],在轉(zhuǎn)化4 d時雄二烯二酮濃度達到12 g/L。申雁冰等發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精可以提高植物甾醇的水溶性[10]。如果把游離細胞法和環(huán)糊精結(jié)合起來,可能會得到比較好的結(jié)果。

因此,本論文使用PB設計法[11]、最陡爬坡路徑法和響應面中的Box-Behnken設計相結(jié)合對雄烯二酮的轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化,提高轉(zhuǎn)化率,以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄甾-4-烯-3,17-二酮標品(純度99.99%) Sigma公司;植物甾醇(純度95%) 西安岳達生物科技股份有限公司;羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD) 山東新大精細化工有限公司;其它試劑 均為市售分析純;菌種:分枝桿菌Mycobacteriumsp. NRRL B-3683 由河南大學生物工程研究所保存;種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,檸檬酸2,檸檬酸鐵銨0.05,K2HPO4·3H2O 0.5,MgSO40.5,玉米漿10,植物甾醇 0.1～1,pH8.0。初始游離細胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)體系組成:0.02 mmol/L pH為8.0磷酸緩沖液100 mL,植物甾醇1 g,羥丙基-β-環(huán)糊精4 g,菌體5 g。

Scout SE電子天平 奧豪斯儀器有限公司;STARTER2100 pH計 奧豪斯儀器(上海)有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;QHZ-98A全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠;BioFLO4000BIOREACTOR 7 L發(fā)酵罐 NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC公司;H1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;氣相色譜GC-2014C 日本島津制作所。

1.2 實驗方法

1.2.1 收集菌體 一級種子培養(yǎng),配制1瓶50 mL種子培養(yǎng)基,121 ℃滅菌30 min。將甘油管接種到培養(yǎng)基里,然后放入搖床中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d。二級種子培養(yǎng),配制3瓶90 mL種子培養(yǎng)基,121 ℃滅菌30 min,然后接種一級種子,接種量10%(V/V),然后放入搖床中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d。7 L發(fā)酵罐:配制2.7 L種子培養(yǎng)基,121 ℃滅菌30 min,冷卻后接種二級種子,接種量10%(V/V)。300 r/min,30 ℃培養(yǎng)1.5 d。然后把種子液用離心機離心,8000 r/min,4 ℃,離心3 min,離心完后倒掉上清液,菌體收集完后,再加入0.02 mmol/L pH為8.0的30 mL磷酸緩沖液潤洗3次,離心收集菌體細胞(菌體濃度為21.6 g/L,濕重),然后放置備用。

1.2.2 游離細胞法生產(chǎn)雄烯二酮工藝優(yōu)化 在500 mL搖瓶里加入1 g甾醇、4 g羥丙基-β-環(huán)糊精和5 g菌體,然后加入0.02 mmol/L pH為8.0的100 mL磷酸緩沖液,在搖床中以180 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng),轉(zhuǎn)化4 d后取樣測定,測得雄烯二酮轉(zhuǎn)化率為47.51%。為了提高雄烯二酮的轉(zhuǎn)化率,設計如下實驗。

1.2.2.1 Plackett-Burman試驗 將初始反應體系的8個組分作為影響因素進行全面考察,選擇11因子及實驗次數(shù)N=12的實驗設計,以X3、X6、X9作為空項以估計實驗誤差,以X1、X2、X4、X5、X7、X8、X10、X11分別代表羥丙基-β-環(huán)糊精濃度、反應時間、磷酸緩沖液濃度、磷酸緩沖液pH、搖床轉(zhuǎn)速、搖床溫度、植物甾醇濃度、菌體量,每個因素取高低2個水平(表1)。

表1 Plackett-Burman設計各因素與水平Table 1 Plackett-Burman experimental factors and levels

1.2.2.2 最陡爬坡試驗 根據(jù)Plackett-Burman實驗設計的結(jié)果,做最陡爬坡實驗。以植物甾醇、羥丙基-β-環(huán)糊精、菌體量為考察因素,以轉(zhuǎn)化率高低為指標,確定合適的范圍。

1.2.2.3 Box-Behnken中心組合試驗 用爬坡設計得出的實驗結(jié)果為依據(jù)進行Box-Behnken設計(表2),用SAS 8.0軟件對實驗進行回歸分析并求得最優(yōu)值,得出響應面分析結(jié)果,確定最佳轉(zhuǎn)化體系,最后依據(jù)回歸方程繪制響應面分析圖。

表2 Box-Beehnken設計因子及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

表3 Plackett-Burman實驗設計Table 3 Plackett-Burman experimental design

1.2.3 雄烯二酮轉(zhuǎn)化率測定

1.2.3.1 樣品處理 取10 mL乙酸乙酯加入1 mL轉(zhuǎn)化液萃取,在搖床中振蕩30 min,轉(zhuǎn)速為200 r/min。然后再取9 mL乙酸乙酯加入1 mL萃取后的轉(zhuǎn)化液(稀釋100倍)。

1.2.3.2 檢測方法 用薄板層析法對雄烯二酮進行定性測量。點樣,剪裁合適大小的硅膠板,在硅膠板底邊1.5～2 cm處畫線,用毛細管吸取試劑在直線上每隔1 cm左右點樣。層析:將展層劑(乙酸乙酯∶正己烷=7∶3)加入層析缸中均勻混合,待硅膠板的樣點涼干后,放置層析缸內(nèi),靜止大約30 min左右,直至展開劑上升到薄板上沿0.5～1.0 cm左右,停止層析。顯色:取出硅膠板,用吹風機吹干,用50%濃硫酸作為顯色劑,放置于105 ℃的烘箱,加熱5～10 min。取出觀察,硅膠板上各物質(zhì)的顯色情況和斑點大小。植物甾醇顯紫色、雄烯二酮顯淺藍色、顯淺黃色的是轉(zhuǎn)化液樣品,成分比較復雜。

采用氣相色譜法進行定量測定[12]。氣相色譜使用裝備有DB-1柱(30 m×0.53 mm×0.25 μm)的Shimadzu GC-2014C,以高純度氮氣作為流動相,速率為1.0 mL/min。初始柱溫為220 ℃,保持3 min,然后以20 ℃/min升溫至280 ℃,保持14 min。進樣口和檢測器FID分別為280和310 ℃。進樣量為2 μL。

式中,C1:轉(zhuǎn)化結(jié)束后雄烯二酮的濃度;100:稀釋倍數(shù);C2:初始植物甾醇的濃度;0.95:植物甾醇的純度;0.70:雄烯二酮與植物甾醇的相對分子質(zhì)量之比(MAD=286.6,M甾醇=406.8)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗做3次,取其平均值作為實際轉(zhuǎn)化率。運用SAS 8.0軟件進行方差分析,采用Origin 8.5軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗結(jié)果

Plackett-Burman實驗設計法是一種近飽和的2水平實驗設計方法。它可以用很少的實驗次數(shù)估出因素的主效應,從大量的考察因素中選出最重要的幾個以供進一步研究[13]。Plackett-Burman實驗設計見表3,分析結(jié)果見表4。從表4的P值大小可以看出,對雄烯二酮轉(zhuǎn)化率具有顯著影響的因子分別是植物甾醇濃度、菌體量以及羥丙基-β-環(huán)糊精濃度,從表4中的t值可以看出,植物甾醇濃度、菌體量對雄烯二酮轉(zhuǎn)化率為正效應,羥丙基-β-環(huán)糊精濃度為負效應。確定這3個因素作為下一步實驗的關鍵因素。

表4 Plackett-Burman實驗分析結(jié)果Table 4 Analytic result of Plackett-Burman experiment

2.2 最陡爬坡實驗

最陡爬坡法以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向,根據(jù)各因素效應值的大小確定變化步長,能快速、經(jīng)濟地逼近最佳值區(qū)域[14]。從表5可以看出,隨著植物甾醇濃度、菌體量依次增大,羥丙基-β-環(huán)糊精濃度依次減小,雄烯二酮的轉(zhuǎn)化率先增大后減小。當植物甾醇濃度為20 g/L,羥丙基-β-環(huán)糊精濃度為80 g/L,菌體量為100 g/L,雄烯二酮轉(zhuǎn)化率(65.71%)最大。所以后續(xù)實驗的中心點按照編號3情況下每個因素的量進行。

表5 最陡爬坡實驗設計結(jié)果Table 5 Experimental design of steepestascent and corresponding results

2.3 響應面設計結(jié)果與分析

3個重要因子的最適濃度范圍確定后,以植物甾醇濃度20 g/L、羥丙基-β-環(huán)糊精濃度80 g/L、菌體量100 g/L為中心點實施響應面分析,設計和結(jié)果分析見表6和表7。用SAS 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

表6 Box-Benhnken試驗設計Table 6 Design of Box-Benhnken experiment

表7 Box-Behnken設計回歸分析Table 7 Regression analysis of Box-Behnken design

圖1～圖3為根據(jù)擬合方程做出的響應面分析圖。從響應面圖可以看出,隨著植物甾醇濃度、羥丙基-β-環(huán)糊精濃度、菌體量的增加,雄烯二酮的轉(zhuǎn)化率是增加的,但不是持續(xù)增大,當這三個因子的濃度到一定值時,雄烯二酮的轉(zhuǎn)化率開始下降。可利用SAS軟件進行脊嶺分析找到這3個因子的最佳值,來得到最大轉(zhuǎn)化率。由SAS 8.0軟件求出,當植物甾醇

圖1 植物甾醇濃度和羥丙基-β-環(huán)糊精濃度對轉(zhuǎn)化率影響的響應面圖Fig.1 Response surface graph of the effectphytosterol concentration and hydroxypropyl-β-cyclodextrin concentration on conversion rate

濃度為19.41 g/L,羥丙基-β-環(huán)糊精濃度為80.14 g/L,菌體量為110.55 g/L,得到雄烯二酮預測最大轉(zhuǎn)化率為67.69%。

圖2 植物甾醇濃度和菌體量對轉(zhuǎn)化率影響的響應面圖Fig.2 Response surface graph of the effect of phytosterolconcentration and bacterial cell amount on conversion rate

圖3 羥丙基-β-環(huán)糊精和菌體量對轉(zhuǎn)化率影響的響應面圖Fig.3 Response surface graph of the effect ofhydroxypropyl-β-cyclodextrin concentrationand bacterial cell amount on conversion rate

2.4 模型驗證

為證實預測結(jié)果,在植物甾醇濃度為19.41 g/L,羥丙基-β-環(huán)糊精濃度為80.14 g/L,菌體濃度為110.55 g/L條件下重復3次搖瓶實驗,結(jié)果分別為66.54%、67.35%、67.86%,平均值為67.25%,與預測值接近,二者的良好擬合性證實了模型的有效性。優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化體系為磷酸緩沖液濃度0.02 mmol/L,磷酸緩沖液pH6.5,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,搖床溫度28 ℃。

圖4為最優(yōu)條件下的雄烯二酮轉(zhuǎn)化率隨時間變化,從圖4中可以看出,第4 d時雄烯二酮轉(zhuǎn)化率最高,達到67.25%,此時雄烯二酮產(chǎn)量為8.68 g/L,生產(chǎn)強度達2.17 g/(L·d)。

圖4 雄烯二酮轉(zhuǎn)化曲線圖Fig.4 The conversion curve of androstenedione

3 結(jié)論

本文利用游離細胞法生產(chǎn)雄烯二酮進行了研究,先通過Plackett-Burman設計快速有效地從8個影響游離細胞轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)雄烯二酮的因素中篩選出3個顯著性影響因素:植物甾醇濃度、羥丙基-β-環(huán)糊精濃度、菌體濃度;然后利用最陡爬坡法逼近最大響應值區(qū)域并用Box-Beehnken設計對轉(zhuǎn)化體系進行優(yōu)化,建立了各因素與雄烯二酮轉(zhuǎn)化率之間的數(shù)學模型,取得了良好的試驗結(jié)果。結(jié)果表明:當植物甾醇19.41 g/L,羥丙基-β-環(huán)糊精80.14 g/L,菌體量110.55 g/L時,雄烯二酮轉(zhuǎn)化率達到67.25%,比優(yōu)化前提高了41.55%。相比于化學法生產(chǎn)雄烯二酮,本論文采用的方法生態(tài)環(huán)保,同時原料來源廣泛,轉(zhuǎn)化率高。游離細胞法生產(chǎn)雄烯二酮的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度均高于發(fā)酵法,具有較大的優(yōu)勢。今后,將進一步優(yōu)化產(chǎn)品的提取純化工藝,提高雄烯二酮的提取收率,為工業(yè)化應用提供基礎數(shù)據(jù)。