邱雪梅,徐 麗,駱海龍,袁 杰,楊 靖,李 蓓,汪靜杰,3,*

(1.湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院,湖北十堰 442000; 2.湖北醫(yī)藥學院生物醫(yī)藥研究院,湖北十堰 442000; 3.武當特色中藥研究湖北省重點實驗室,湖北十堰 442000)

肺炎克雷伯菌為革蘭氏陰性細菌、細桿菌,可寄居于動物呼吸道及人腸道內(nèi)成為條件致病菌;是引起社區(qū)獲得性感染與醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌,嚴重威脅著人類的健康[1-2]。肺炎克雷伯菌可通過食品尤其是肉類食品經(jīng)由腸道進入機體引起感染[3];所致感染包括肺炎、尿道炎等常見疾病,還可造成眼內(nèi)炎、高血糖、腦炎等并發(fā)癥疾病[4-5]。

目前已有研究報道從家畜體內(nèi),及零售肉類、海產(chǎn)品、蔬菜中分離出肺炎克雷伯菌[6-10]。經(jīng)污染食品或吸入等途徑進入機體的肺炎克雷伯菌,在胃腸道內(nèi)會面臨一些對細菌具有抑制作用的腸道因子,如氧化刺激、高滲環(huán)境、膽汁酸鹽、低pH等的脅迫作用[11-14]。其中氧化因子是腸道抵御外來細菌的重要因素,可造成細菌的氧化損傷,破壞細胞壁、蛋白質、DNA等,干擾細胞代謝途徑,從而發(fā)揮抑制細菌作用;在氧化脅迫下,細菌可依靠多種方式與機制應對脅迫,包括抗氧化酶系統(tǒng)、調整代謝途徑、激活相關生物表型等途徑[15-19]。然而關于肺炎克雷伯菌與氧化因子互作的研究鮮有報道,其應對氧化脅迫的機制尚不明確。

本研究選用不同濃度H2O2處理肺炎克雷伯菌,進行體外模擬腸道氧化因子實驗,探究H2O2處理條件下細菌的生長速率及主要毒力因子表型莢膜、生物膜的變化,并通過qRT-PCR檢測分析毒力表型相關基因的表達水平。本研究內(nèi)容旨在為揭示肺炎克雷伯菌響應機體腸道氧化條件脅迫的機制奠定理論依據(jù);并為食品污染途徑的肺炎克雷伯菌的感染性疾病防控提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株為肺炎克雷伯菌NTUH-K2044株,是引起肝膿腫的代表菌株 由軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所饋贈,保存于湖北醫(yī)藥學院病原生物學研究室;蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、瓊脂 OXOID公司;LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基 由10 g/L蛋白胨、5 g/L 酵母粉、2.5 g/L氯化鈉、5 g/L瓊脂配制而成;二甲基亞楓(DMSO) Amresco公司;結晶紫 Sigma公司;30%過氧化氫(H2O2) 索萊寶生物公司;RNA提取試劑盒 Omega公司;逆轉錄試劑盒 Thermo Fisher Scientific公司;熒光定量PCR檢測試劑盒 Bio-Rad公司;基因表達檢測的引物 上海生工生物公司。

5424R高速離心機 德國Eppendorf公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;THZ-82B型恒溫搖床 常州國旺儀器設備有限公司;BioSpectrometer Kinetic紫外分光光度計 德國Eppendorf公司;恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;CFX96熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 首先從-80 ℃超低溫冰箱中取出低溫凍存的肺炎克雷伯菌NTUH-K2044野生型菌株,37 ℃條件下均勻解凍、融化,并用接種環(huán)取適量融化的菌液劃線接種到LB固體培養(yǎng)基平板上進行菌種活化。然后從活化培養(yǎng)基平板上分別挑取單菌落轉接至含有氨芐青霉素(50 μg/mL)的新鮮LB液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基平板,37 ℃條件下培養(yǎng)備用。

1.2.2 氧化脅迫條件下細菌生長速率測定 以過氧化氫(H2O2)體外模擬腸道氧化條件,并檢測該脅迫下肺炎克雷伯菌的生長速率。分別配制含0.195、0.39、0.78、1.56 mmol/L濃度梯度H2O2的LB液體培養(yǎng)基,然后將活化培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌菌液OD600調至1.2后作為菌懸液母液。取適量母液按1∶100比例接種至分別裝有100 mL含4種不同濃度H2O2的LB液體培養(yǎng)基三角燒瓶中,并以接種菌液至未添加H2O2的液體培養(yǎng)基為對照組。已接種菌液的各液體培養(yǎng)基分別放入搖床,37 ℃,180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。在1、2、3、4、5、6、7、8、9 h時間點分別檢測菌液的OD600值,記錄數(shù)據(jù)并繪制細菌的生長曲線。

1.2.3 莢膜生成能力分析 利用液體培養(yǎng)離心實驗法檢測氧化因子處理條件下莢膜的生成能力[20]。首先將肺炎克雷伯菌劃線接種至固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),然后取少許菌落液體培養(yǎng)過夜,并分別取50 μL活化的菌液接種至含不同濃度梯度(0.195、0.39、0.78 mmol/L)H2O2與未添加H2O2的5 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h 后,各取1 mL菌液在8000 r/min條件下離心10 min后,觀察細菌在離心管管底的沉淀程度,以分析肺炎克雷伯菌的莢膜生成量變化。

1.2.4 生物膜形成能力檢測 將過夜活化培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌株以1∶100的比例分別轉接于含有0.195、0.39、0.78 mmol/L濃度H2O2的LB液體培養(yǎng)基小試管中,每種濃度梯度設置3個重復,未添加H2O2的培養(yǎng)基為對照。參考文獻[21]的方法并適度調整,室溫靜置連續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測菌株在試管中形成生物膜的情況;首先從生物膜中間輕輕吸取菌液至另一滅菌的小試管中,檢測各處理組菌株的OD600值。在含生物膜的原試管中用滅菌水潤洗去游離細菌,加入0.1%結晶紫染液室溫下靜置染色30 min。然后棄去染色液并用滅菌水潤洗至少3次,每管加入4 mL DMSO溶液溶解試管壁上的結晶紫,檢測DMSO混勻溶解液的OD570值,每樣品重復3次。并按100×OD570/OD600計算方法計算各實驗組菌株的生物膜相對形成量。

表1 定量PCR檢測靶基因所用引物Table 1 Primers used for target genes of qRT-PCR examination

1.2.5 qRT-PCR實時熒光定量分析 結合氧化脅迫條件下肺炎克雷伯菌莢膜與生物形成能力表型檢測結果,并分析相關基因的表達量。將活化的肺炎克雷伯菌分別接種在含低濃度(0.195、0.39 mmol/L)H2O2與未添加H2O2的液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h后各取3 mL 菌液分別提取RNA。按cDNA逆轉錄試劑盒說明書的操作步驟,以各處理組RNA為模板反轉錄出第一鏈cDNA保存于-80 ℃?zhèn)溆?。同時選取肺炎克雷伯菌莢膜、生物膜形成相關的8個基因為檢測基因,16S rRNA作內(nèi)參基因;各基因引物見表1。分別從不同處理組取適量cDNA為模板進行qPCR檢測,反應條件為:95 ℃,預變性3 min;95 ℃ 變性10 s,58 ℃退火30 s,65 ℃ 延伸5 s,39個循環(huán),95 ℃ 0.5 s,繪制溶解曲線。3次實驗重復,按2-ΔΔCt法分析基因表達量數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 氧化脅迫對肺炎克雷伯菌生長的影響

如圖1所示,肺炎克雷伯菌在4個不同濃度梯度H2O2條件下培養(yǎng)時,隨著氧化因子濃度升高,肺炎克雷伯菌生長受到影響越明顯;表現(xiàn)出濃度依賴的抑制效果。在0.195、0.39 mmol/L較低濃度處理時,分別在3、4 h時間點前細菌生長相較于對照組生長受到抑制,而在4 h時間點之后,低濃度的氧化因子脅迫條件對細菌生長無明顯的影響。當氧化因子濃度達到0.78、1.56 mmol/L時,細菌生長受到明顯抑制作用;除對細菌而言的極端濃度氧化因子(1.56 mmol/L)外,其他濃度處理下,細菌生長在8 h時間點后各處理組間無明顯差異。這些結果說明:在非極端濃度氧化因子脅迫下,肺炎克雷伯菌早期生長過程受到抑制作用,而在中后期對細菌的生長無明顯影響;暗示肺炎克雷伯菌可能通過相關調控方式響應脅迫而逐漸適應該不利環(huán)境。

圖1 肺炎克雷伯菌氧化脅迫處理下的生長曲線Fig.1 Growth curve of Klebsiellapneumoniae under oxidative stress

2.2 肺炎克雷伯菌氧化因子脅迫下莢膜生成能力變化

體外氧化因子H2O2處理對肺炎克雷伯菌的生長表現(xiàn)出一定的抑菌效果,并可進一步地研究肺炎克雷伯菌毒力表型與響應氧化脅迫間的關聯(lián)。因高濃度氧化因子(1.56 mmol/L)處理下肺炎克雷伯菌的生長受到顯著抑制,不利于后續(xù)的表型分析;故本研究通過高速離心實驗分析了3個不同濃度(0.195、0.39、0.78 mmol/L)氧化因子H2O2脅迫對肺炎克雷伯菌主要毒力因子之一莢膜生成量的實驗。如圖2所示,在所選不同濃度H2O2脅迫處理作用下,與對照組相比,隨著H2O2處理濃度升高,高速離心時各處理組的肺炎克雷伯菌越易在管底沉淀聚集,表明莢膜的生成量降低,不易粘稠、在管底上方形成云霧狀;說明氧化脅迫條件能夠減弱肺炎克雷伯菌莢膜的生成能力,也表現(xiàn)出濃度劑量相關性。

圖4 氧化脅迫對肺炎克雷伯菌莢膜、生物膜相關基因表達量的影響Fig.4 Effect of oxidative stress on the expression of capsule and biofilm related genes in Klebsiella pneumoniae

圖2 不同濃度氧化脅迫對肺炎克雷伯菌莢膜生成量的影響Fig.2 Effects of oxidative stress at different concentrationson capsule production of Klebsiella pneumoniae

2.3 氧化脅迫對生物膜形成能力的影響

肺炎克雷伯菌生物膜的形成與其致病性密切相關,生物膜是其重要的毒力因子[22-23]。本研究通過結晶紫染色方法定量檢測肺炎克雷伯菌的生物膜形成量,圖3所示的染色實驗結果表明相對于對照組,在0.195、0.39 mmol/L 低濃度的H2O2處理組中肺炎克雷伯菌的生物膜形成量均增加;在0.78 mmol/L高濃度 H2O2處理脅迫下肺炎克雷伯菌生物膜生成量增加最明顯。結合不同濃度梯度氧化因子對肺炎克雷伯菌生長影響的實驗結果,說明在非極端濃度的氧化因子脅迫下,肺炎克雷伯菌通過調控其重要毒力因子生物膜表型以響應該脅迫環(huán)境。

圖3 肺炎克雷伯菌氧化脅迫下生物膜形成量的變化Fig.3 Changes of biofilm formation underoxidative stress of Klebsiella pneumoniae注:* 表示處理組與對照組相比,具有顯著差異性(P<0.05);**表示處理組與對照組相比,具有極顯著差異性(P<0.01),圖4同。

2.4 響應氧化脅迫的相關基因表達量變化

為了進一步探究氧化條件下肺炎克雷伯菌的毒力表型相關基因的表達情況。本研究選取了8個莢膜與生物膜形成相關基因bsmpA、bssS、rcsA、LuxR、magA、rmpA、YbaJ、YmgB,其中rmpA、rcsA、magA為莢膜生成相關的基因,其他為生物膜形成相關的基因。結合表型實驗結果,0.195、0.39 mmol/L兩個濃度H2O2處理組反映了肺炎克雷伯菌莢膜與生物膜表型的典型變化特征,并進一步地利用熒光定量PCR方法檢測各靶基因在這2個濃度H2O2氧化脅迫下的表達量;結果顯示(圖4):在氧化因子H2O2處理條件下,相對于對照組,bsmpA、bssS、LuxR、magA、rmpA、YmgB基因的表達量降低;YbaJ基因相對于對照組均表現(xiàn)出表達量升高,rcsA基因在0.39 mmol/L濃度作用下表達量上調。結合氧化因子影響肺炎克雷伯菌表型實驗結果,H2O2抑制莢膜的產(chǎn)生,可能與影響莢膜結構基因magA表達量有關。生物信息分析顯示YbaJ基因為生物膜形成調控子,推測該基因表達量的升高而促進肺炎克雷伯菌生物膜形成量增加。說明肺炎克雷伯菌通過調控YbaJ基因的上調表達，促進生物膜的形成，以此響應氧化脅迫。

3 討論

肺炎克雷伯菌可通過污染食物經(jīng)胃腸道途徑進入人體,此途徑會經(jīng)歷胃腸道一系列腸道環(huán)境因子的刺激。其中氧化因子是抑制外來微生物的主要因素之一,本研究通過體外實驗以H2O2模擬腸道氧化條件進行體外實驗檢測對肺炎克雷伯菌的生長、表型特征以及毒力基因表達的影響。這些問題的揭示可為細菌與宿主互作、細菌致病機制提供基礎數(shù)據(jù)。

為了分析肺炎克雷伯菌在宿主腸道的氧化條件脅迫時,其生長與相關表型的變化，本研究首先體外模擬分析肺炎克雷伯菌在氧化因子處理下生長,實驗結果表明細菌生長的早期階段受到較明顯的抑制。氧化因子H2O2作為一種強氧化劑,即使低濃度也可對包括細菌在內(nèi)微生物細胞壁具有較強的破壞作用[14,24],故能對肺炎克雷伯菌的生長表現(xiàn)出抑制作用,而在生長后期與對照組相比無明顯差異,該結果暗示肺炎克雷伯菌作為腸道途徑感染為主的病原菌,在宿主的氧化環(huán)境下可能利用某種調控機制參與響應脅迫,最終以適應該不利條件。

當細菌進入宿主體內(nèi),面臨不利于自身生長、定植等腸道因子時會啟動相關基因的表達,可通過調控特定的表型特征變化以應激該不利環(huán)境條件,如霍亂弧菌、彎曲桿菌、沙門氏菌等可以通過增加莢膜、生物膜形成量去應激脅迫環(huán)境[25-28]。文獻報道肺炎克雷伯菌的毒力因子主要包括莢膜、生物膜、菌毛等[29-32]。本文中體外氧化因子H2O2處理條件下肺炎克雷伯菌的莢膜產(chǎn)生量明顯降低,說明該因子作用下能夠下調莢膜調控或合成相關基因的表達。文獻報道,肺炎克雷伯菌的magA為結構基因,是合成莢膜的關鍵基因[33];qRT-PCR實時定量結果顯示在氧化因子H2O2作用下,magA基因表達量發(fā)生了明顯的下調,可知氧化因子通過影響肺炎克雷伯菌莢膜結構基因magA的下調表達從而降低其莢膜的產(chǎn)生量。轉錄調控子rmpA、rcsA可參與調控促進肺炎克雷伯菌莢膜的生成[34-35],本研究中在0.195 mmol/L濃度H2O2處理時,rmpA、rcsA基因的表達受到極顯著抑制(P<0.01)。同時在0.39 mmol/L濃度組的表達量高于0.195 mmol/L濃度組,暗示可能與轉錄調控子rmpA、rcsA感應氧化濃度有關;但0.39 mmol/L濃度對肺炎克雷伯菌的氧化損傷與破壞能力更強,抑制破壞莢膜結構的作用更明顯;故總體上仍表現(xiàn)出劑量相關性。

肺炎克雷伯菌在生長過程中能形成生物膜,生物膜作為其重要毒力表型,對其致病性與耐藥性具有明顯的促進作用;本文中生物膜定量檢測結果顯示在低濃度的H2O2脅迫作用下,肺炎克雷伯菌的生物膜形成量反而增加;這一結果表明肺炎克雷伯菌可能通過提高生物膜形成量以響應氧化因子的脅迫。且進一步的qRT-PCR結果可知肺炎克雷伯菌在該脅迫條件處理時會上調表達生物膜形成相關基因YbaJ的表達,控制生物膜的形成。此外生物膜形成相關基因bsmpA、bssS、LuxR、YmgB在氧化脅迫下表達量均下調,暗示這4個基因可能不參與響應氧化脅迫促進肺炎克雷伯菌生物膜的形成;0.39 mmol/L濃度組的基因表達量高于0.195 mmol/L濃度組,推測可能與其多重生物功能有關,在氧化脅迫時不發(fā)揮主效作用。生物膜作為肺炎克雷伯菌的重要毒力因素,其形成能力提高可能是該菌響應氧化脅迫的重要調控機制。

4 結論

綜上所述,肺炎克雷伯菌在氧化因子脅迫處理的生長速率實驗顯示該菌會響應該脅迫而逐漸適應該環(huán)境,早期生長變緩而至平穩(wěn)期細菌的生長不受影響。但氧化脅迫對肺炎克雷伯菌的主要毒力表型特征有明顯的影響,表現(xiàn)為降低毒力因子莢膜的生成量,但增加生物膜的形成量。毒力相關基因表達的結果從分子層面驗證了表型實驗結果,也暗示肺炎克雷伯菌通過調控生物膜的形成相關基因的表達,從而控制該毒力表型以響應氧化脅迫。本研究的結果能夠為肺炎克雷伯菌與宿主腸道因子互作及致病機制提供新思路,同時也為食源性肺炎克雷菌感染性疾病的防控提供新靶點。