文 攀,裴志勝,朱婷婷,于紫娟,耿玉坤,陳彩玉,薛長風(fēng),*

(1.海南熱帶海洋學(xué)院,海南三亞 572022: 2.海南省海洋食品工程技術(shù)研究中心,海南三亞 572022; 3.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,海南熱帶海洋學(xué)院,海南三亞 572022)

黃皮[ClausenaLansium(Lour.)Skeels(C.Wampi Blanco)],蕓香科黃皮屬(黃皮果屬)常綠喬木,在我國海南、廣東、廣西、臺灣等地種植較多[1]。黃皮果實富含糖、有機(jī)酸、果膠、維生素C、揮發(fā)油、黃酮苷等,且具有健脾開胃、消痰化氣、潤肺止咳、去疳積等功效,具有較高的食用、藥用價值[2]。黃皮果上市時間集中在5月中旬～7月初之間,逢臺風(fēng)、梅雨季,但果實保鮮方面仍處于瓶頸,不及時加工往往帶來大量黃皮果的損失。目前關(guān)于黃皮的果皮、葉子、莖和根等的研究已經(jīng)極大地擴(kuò)展了黃皮資源的應(yīng)用[3-12],但黃皮果肉的研究則主要集中于黃皮果醬、果脯、軟飲料等初級產(chǎn)品的開發(fā)[13-18],而關(guān)于黃皮果肉膳食纖維的研究則未見相關(guān)報道。

膳食纖維是指在人體小腸內(nèi)抵抗消化吸收而在大腸內(nèi)能夠完成或部分發(fā)酵的多糖類物質(zhì)。研究表明可溶性膳食纖維(Soluble Dietary Fiber,SDF)的生理功能有助于預(yù)防高血脂、糖尿病、冠心病等疾病[19-22],黃皮果肉中SDF的制備有利于拓展黃皮果的精深加工,為黃皮果的深入開發(fā)利用提供參考。

目前對于膳食纖維的提取主要方法有酸堿法[23]、酶法[24]、超聲波輔助酶法[25-26]、微波-化學(xué)法[27]等。酶法制備膳食纖維無溶劑殘留,但不容易破壞提取物結(jié)構(gòu),且需要適宜的酶解溫度。超聲波的機(jī)械振動則有助于膳食纖維的溶出[28],微波則可提供高能使物質(zhì)內(nèi)外溫度快速升高。三者的協(xié)調(diào)作用對膳食纖維提取的研究鮮有報道。因此,本實驗以黃皮果肉為原料,利用響應(yīng)面法采用超聲波-微波協(xié)同輔助酶法萃取SDF,對SDF進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征及單糖組分分析,為黃皮果肉SDF的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃皮果 海南三亞南濱農(nóng)場;糖化酶(10萬U/g) 博立生物制品有限公司;纖維素酶(10萬U/g) 和氏璧生物科技有限公司;95%乙醇、磷酸緩沖液、鹽酸、亞硝酸鈉、溴化鉀(光譜級) 西隴科學(xué)股份有限公司;MES-TRIS緩沖液 天津市永大化學(xué)試劑有限公司;2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS) 合肥博美生物有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 日本東京化成工業(yè)株式會社;沒食子酸、三氯化鐵、福林酚試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

T6新世紀(jì) 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Pilot7-12E 真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;TRACE 1300氣相色譜儀 美國Thermo公司;IRAffinity-1 傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司;XO-SM300超聲波微波協(xié)同萃取儀 南京先歐儀器制造有限公司;HSC-2差示掃描量熱儀 北京恒久實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃皮果肉SDF提取工藝 將一定比例的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0～4.5)加入黃皮果肉粉(M2)中并充分?jǐn)嚢柚粱旌暇鶆?加入一定比例的糖化酶、纖維素酶,于超聲波-微波萃取儀中處理(控溫模式55 ℃)[23]。處理液于4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min,取上層液置于4倍的95%乙醇中,4 ℃下靜置過夜。過夜物料4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min,取沉淀物冷凍干燥,得到黃皮果肉SDF粗提物,稱重得M1。SDF得率按下式計算:

式中:Y為SDF得率,%;M1為提取的粗SDF重量,g;M2為樣品重量,g。

1.2.2 SDF凈產(chǎn)率的測定 參考國標(biāo)GB 5009.88-2014的方法[29],測定黃皮果肉中提取的粗SDF的純度,純度根據(jù)GB 5009.88-2014測定。利用公式計算凈產(chǎn)率如下[30]:

膳食纖維凈產(chǎn)率(%)=Y×純度

式中:Y為SDF得率,%。

1.3 黃皮果肉中SDF的提取單因素實驗

在固定溫度為55 ℃,糖化酶用量為0.5%的基礎(chǔ)上,單因素試驗設(shè)計為:設(shè)定超聲功率300 W、超聲時間20 min、纖維素酶用量0.6%,考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL條件下SDF的得率;設(shè)定料液比1∶25 g/mL、超聲功率300 W、纖維素酶用量0.6%,考察改變超聲時間10、15、20、25、30 min條件下SDF的得率;設(shè)定料液比1∶20 g/mL、超聲時間25 min、纖維素酶用量0.6%,考察改變超聲功率100、200、300、400、500 W條件下SDF的得率;設(shè)定料液比1∶15 g/mL、超聲功率300 W、超聲時間15 min,考察纖維素酶用量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%條件下SDF的得率。

1.4 超聲波輔助提取SDF響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以SDF得率為指標(biāo),將料液比、超聲時間、超聲功率、加酶量為自變量,設(shè)計四因素三水平實驗的Box-Behnken響應(yīng)面試驗,如表1所示，確定最佳提取條件。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.5 黃皮果肉中SDF理化性質(zhì)測定

1.5.1 膨脹力(SWC)的測定 稱取SDF 100 mg放入10 mL的玻璃試管中,加純水5 mL,振勻后在室溫下放置24 h,即讀取液體中膳食纖維的體積變化。膨脹力用每克干物質(zhì)的膨脹體積來表示,計算如公式所示[31]。

SW(mL/g)=[膨脹后體積(mL)-干樣品體積(mL)]/樣品干質(zhì)量(g)

1.5.2 持水力(WHC)的測定 稱取SDF 0.5 g樣品放入100 mL燒杯中,加入純水10 mL,振動均勻后在37 ℃水浴中放置12 h,以4000 r/min,離心15 min后稱重,計算如公式所示[32]。

1.5.3 持油力(OHC)的測定 準(zhǔn)確稱取0.1 g SDF置于1.5 mL的離心管中,加入1 g食用花生油,振動均勻后在37 ℃水浴中放置12 h,以4000 r/min,離心15 min后稱重。計算如公式所示[33]。

OHC(g/g)=[吸附后的樣品質(zhì)量(g)-樣品干質(zhì)量(g)]/樣品干質(zhì)量(g)

1.6 SDF的結(jié)構(gòu)表征

1.6.1 掃描電鏡形貌觀察 將冷凍干燥后的樣品固定在樣品臺上鍍金,鍍金方法:離子濺射,鍍金條件:15 kV、15 mA、2.5 min,最后將樣品置于掃描電子顯微鏡(10 kV)下觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

1.6.2 傅里葉變換紅外光譜的測定 精確稱取干燥SDF樣品2 mg于瑪瑙研缽中,加入200 mg干燥的KBr晶體,在紅外燈照射下輕輕研磨至極細(xì)混勻,用壓片機(jī)壓制成薄片,用紅外分光光度計于400～4000 cm-1中紅外區(qū)掃描,測定傅里葉變換紅外光譜曲線[34]。

1.7 SDF單糖組分GC分析

1.7.1 單糖混合物的制備 稱取制備樣品50 mg于安瓿管中,加入10 mL 2 mol/L的三氟乙酸,酒精噴燈封口。將其放置于105 ℃干燥箱中水解8 h,待溶液冷卻至室溫后,70 ℃恒溫水浴加熱10 min。取樣品水解液于具塞試管中,放入50 ℃、0.09 MPa真空干燥箱中干燥[35]。

1.7.2 糖腈乙?；苌磻?yīng) 將1.7.1中真空干燥好的樣品中加入50 mg鹽酸羥胺、2.5 mL無水吡啶,加塞于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min,用混合器振蕩混勻,待其冷卻至室溫后加入5.0 mL無水醋酸酐,加塞于90 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min,用混合器振蕩混勻,冷卻室溫即為膳食纖維的單糖衍生物。

1.7.3 標(biāo)準(zhǔn)品單糖衍生化 準(zhǔn)確稱取各種單糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,衍生方法參照1.7.2樣品衍生化。

1.7.4 GC分析條件 色譜柱:日本島津公司Rtx-1毛細(xì)管柱(0.5 μm×0.32 mm×30 m);檢測器:氫火焰離子化檢測器;載氣:高純氮,流速1 mL/min,分流比為45∶1。氣化室溫度:280 ℃;檢測器溫度:260 ℃;程序升溫:120 ℃保持2 min,然后以10 ℃/min升至180 ℃,保持8 min,再以10 ℃/min升至240 ℃,保持5 min;240 ℃保持15 min;進(jìn)樣量:1 μL。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.1、Excel 2007、SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)的表示方式為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(3次重復(fù))。所有表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比對黃皮果肉SDF得率的影響 由圖1可知,隨著料液比的增大,SDF得率先升高再降低,在料液比為1∶20 g/mL時,得率達(dá)到最大值為12.05%。料液比從1∶10 g/mL到1∶20 g/mL,得率升高,可能是由于料液比增大使黃皮果肉粉在溶劑中擴(kuò)散開來后,與溶劑的接觸面積變大,使得率增大;料液比超過1∶20 g/mL后得率下降,可能是隨著溶劑的增加,反應(yīng)中的酶濃度降低,使得SDF得率降低,故選擇料液比1∶20 g/mL為中心點。

圖1 料液比對得率的影響Fig.1 The influence of materialliquid ratio on extraction rate

圖2 超聲時間對得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonictime on the extraction rate

2.1.2 超聲時間對黃皮果肉SDF得率的影響 由圖2可知,隨著超聲時間的增長,得率整體呈上升的趨勢,在25 min時,得率趨于平緩,一定的超聲波時間可以使溶劑同物料更好地接觸,超聲波的機(jī)械振動和空穴效應(yīng)加快了果肉粉內(nèi)部的分子移動速度,提升了酶解的效率,使超聲提取的效果更好。但在超聲時間30 min時,醇沉后得到的物質(zhì)呈果凍狀,出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是因為超聲時間增加,超聲波的機(jī)械剪切作用使膳食纖維及果肉中的其他大分子結(jié)構(gòu)遭到破壞[36],從而被部分降解溶出至上層清液中,并在隨后的醇沉處理中與可溶性膳食纖維一并沉淀。故選擇超聲時間25 min為中心點。

2.1.3 超聲功率對黃皮果肉SDF得率的影響 由圖3可知,隨著超聲功率升高,得率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢,且趨勢較為明顯。在超聲功率為300 W時,達(dá)到最大得率為12.01%。在超聲功率小于300 W時,得率升高,是因為超聲波具有一定的空化作用和機(jī)械振動的特性,隨著超聲功率的增大,可以在短時間內(nèi)使黃皮果肉的組織受到破壞,使其中果膠等可溶性物質(zhì)加速進(jìn)入緩沖溶劑中,得率升高,在功率為300 W時達(dá)到最大。而在超聲功率大于300 W時,得率開始下降,出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是,高功率的機(jī)械剪切的作用過于劇烈,使SDF結(jié)構(gòu)也遭到破壞[37],同時超聲波功率過大,會引起纖維酶開始失活,使酶解反應(yīng)無法順利進(jìn)行[25],從而造成SDF得率急速下降。故選擇超聲功率300 W為中心點。

圖3 超聲功率對得率的影響Fig.3 The influence of ultrasonicpower on extraction rate

2.1.4 加酶量對黃皮果肉SDF得率的影響 由圖4可知,隨著纖維素酶添加量的增加,SDF得率呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢,且趨勢較為明顯。在纖維素酶添加量為0.6%時,達(dá)到最大得率12.48%。繼續(xù)增大纖維素酶添加量,SDF得率呈下降趨勢。這是因為隨著纖維素酶用量的提高,纖維素酶將IDF降解為溶解度更高的葡聚糖,SDF得率隨著增大,當(dāng)纖維素酶用量達(dá)0.6%時,SDF得率達(dá)到最大。當(dāng)繼續(xù)增大酶的用量,纖維素酶會將葡聚糖水解為分子量更低的寡葡聚糖、纖維二糖和單糖,在隨后的醇沉反應(yīng)中難以沉淀,因此SDF得率會明顯下降[38]。故選擇加酶量0.6%為中心點。

圖4 加酶量對得率的影響Fig.4 The effect of enzyme quantity on extraction rate

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立與分析 利用SAS 9.3建立響應(yīng)面模型并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計,以得率為響應(yīng)值,料液比、超聲時間、超聲功率、加酶量為因變量,設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面分析實驗,空白實驗重復(fù)3組,共27 組。試驗因素水平結(jié)果如表2所示,方差分析結(jié)果見表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計試驗及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

對照表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到如下二次回歸方程:

2.2.2 響應(yīng)面分析 如圖5所示,當(dāng)其他因素水平不變時,兩個因素水平發(fā)生變化對響應(yīng)值所發(fā)生的影響情況圖。等高線的形狀可以反映不同因素之間交互作用的強(qiáng)弱,等高線為鞍型或橢圓形表示兩者交互作用顯著,等高線為圓形則表示兩者交互作用不顯著[39]。圖5c響應(yīng)面的曲線走勢陡峭,等高線為鞍型,說明料液比和加酶量兩個因素相互作用顯著;其他交互作用對應(yīng)的響應(yīng)面曲面較平緩,表明對響應(yīng)值無顯著影響,同表3的方差分析結(jié)果一致。

圖5 提取條件對黃皮果肉SDF得率影響的交互作用響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of interaction between various extraction conditions on yield of SDF from Clausena lansium sarcocarp

2.2.3 回歸模型的驗證 利用SAS軟件進(jìn)行分析,得到黃皮果肉中SDF最佳提取工藝為,X1料液比1∶22.97 g/mL、X2超聲時間24.37 min、X3超聲功率279.52 W、X4加酶量0.64%。預(yù)測SDF得率Y理論值為12.57%。結(jié)合實驗可操作性,將最優(yōu)提取工藝實驗參數(shù)確定為:料液比1∶23 g/mL、超聲時間25 min、超聲功率280 W、加酶量0.64%。稱取等量黃皮果肉5份,按照實驗確定的工藝條件進(jìn)行驗證實驗,得到的SDF得率平均值為12.55%,與預(yù)測值相差0.13%,純度為79.65 g/100 g,凈產(chǎn)率為10.00%,進(jìn)一步驗證了該回歸模型的擬合度較好,模型較為合理有效。

2.3 黃皮果肉SDF的理化性質(zhì)

對制備的黃皮果肉SDF進(jìn)行理化特性指標(biāo)測定,結(jié)果見表4。

表4 SDF的理化性質(zhì)Table 4 Physicochemical properties of SDF

由表4可知,SDF具有較強(qiáng)的膨脹性,其膨脹力為39.25 mL/g,說明SDF中親水基團(tuán)和保持水分的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)所占比例較高。SDF具有一定的持水力,充分吸水后導(dǎo)致內(nèi)容物體積增大,增強(qiáng)飽腹感,加快人體代謝,有助于預(yù)防結(jié)腸癌等腸道疾病[40];SDF具有一定的吸油力,可吸收脂肪,防止脂肪的堆積。黃皮果肉SDF與藍(lán)莓果渣[41]SDF的膨脹力(40.34 mL/g)相比,均有較高的膨脹力,說明黃皮果肉SDF有一定的開發(fā)潛力。

2.4 可溶性膳食纖維的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 可溶性膳食纖維掃描電鏡結(jié)果 圖6可知黃皮果肉SDF在高倍鏡下放大600倍結(jié)構(gòu)呈片狀,在1000倍下可見片狀結(jié)構(gòu)表面呈現(xiàn)褶皺狀、致密,在3000倍和5000倍下SDF表明則平滑,呈現(xiàn)褶皺狀,凹槽深,相對表面積大。

圖6 水溶性膳食纖維的掃描電鏡結(jié)果Fig.6 SEM results of water-soluble dietary fiber

2.4.2 傅里葉變換紅外光譜 由圖7可知,SDF在3200～3500 cm-1內(nèi)出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰,為O-H的伸縮振動峰,由于分子間和分子內(nèi)氫鍵的形成,此處吸收峰較寬,說明其中處于締合狀態(tài)的氫鍵較多[42]。在2800～2933 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰,是糖類甲基和亞甲基的C-H鍵的伸縮振動峰[43];1200～1400 cm-1附近出現(xiàn)的是C-H變角振動峰,這些吸收峰都是糖類的特征吸收峰。在1600 cm-1附近出現(xiàn)了較強(qiáng)的吸收峰,是羧基COO-的特征峰。在1000 cm-1附近存在較大吸收峰,是由兩種C-O伸縮振動引起的,分別為C-O-H和糖環(huán)C-O-C,或者由一級醇的O-H變角振動引起,因此分子存在C-O-H和糖環(huán)C-O-C結(jié)構(gòu)。810 cm-1處有吸收,表明含半乳糖。1418 cm-1附近是C-H的彎曲振動峰,是木聚糖的特征峰[45]。SDF具有糖類的特征吸收峰,有多糖紅外圖譜的典型特征[46]。

圖7 SDF的傅里葉變換紅外光譜分析Fig.7 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of SDF

2.5 DF中單糖組成成分含量測定結(jié)果分析

2.5.1 單糖線性回歸方程 以各峰面積(pA)為縱坐標(biāo)(Y),各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線,計算回歸方程及決定系數(shù)。

表6 樣品中單糖的含量Table 6 Monosaccharide content in sample

結(jié)果見表5,決定系數(shù)R2均大于0.98,說明方程擬合良好。

表5 各種單糖的回歸方程及決定系數(shù)Table 5 Regression equations and correlationcoefficients of various monosaccharides

2.5.2 黃皮果肉DF中單糖組分分析 通過對標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的衍生物進(jìn)行氣相色譜分析,對比保留時間對本試驗選取的單糖進(jìn)行定性分析,由于其他雜質(zhì)成分的干擾,在標(biāo)樣和樣品中都出現(xiàn)了一些雜峰。單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物及黃皮果肉SDF GC出峰圖見圖8、圖9。

圖8 標(biāo)準(zhǔn)單糖GC出峰圖Fig.8 GC chromatogram of monosaccharides注:1:鼠李糖;2:阿拉伯糖;3:半乳糖;4:葡萄糖;5:甘露糖;6:山梨糖。

圖9 SDF中單糖衍生物的氣相色譜圖Fig.9 Gas chromatogram of monosaccharide derivatives in SDF注:1:阿拉伯糖;2:半乳糖;3:葡萄糖;4:甘露糖。

經(jīng)對比標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品衍生物和黃皮果肉SDF的保留時間發(fā)現(xiàn),通過比對標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積,結(jié)果見表6。SDF中四種單糖的摩爾比為:12∶7.5∶3∶1(阿拉伯糖∶葡萄糖∶半乳糖∶甘露糖)。SDF中含量較高的單糖依次為阿拉伯糖(36.31%)、葡萄糖(27.59%)。阿拉伯糖、半乳糖主要來自于半纖維酸水解產(chǎn)生的已糖和戊糖[47],研究表明[48],可溶性半纖維素能降低食用高膽固醇飲食大鼠的血清TC及肝臟脂肪積累,可溶性膳食纖維來源的擴(kuò)展有利于食品行業(yè)的不斷發(fā)展。

3 結(jié)論

在固定溫度為55 ℃,糖化酶用量為0.5%的基礎(chǔ)上,黃皮果肉中SDF的最佳提取條件為:料液比1∶23 g/mL、超聲時間25 min、超聲功率280 W、纖維素酶加酶量0.64%,SDF得率平均值為12.55%。純度為79.65 g/100 g,凈產(chǎn)率為10.00%。黃皮果肉SDF的形貌緊密,表明呈現(xiàn)光滑的褶皺型,傅里葉紅外光譜具有多糖類的特征吸收峰。黃皮果肉SDF含有四種單糖,其中阿拉伯糖(36.31%)、葡萄糖(27.59%)含量較高。黃皮果肉SDF具有較強(qiáng)的膨脹性,其膨脹力為39.25 mL/g,說明SDF中親水基團(tuán)和保持水分的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)所占比例較高。黃皮果肉中可溶性膳食纖維的研究有利于黃皮果精深加工的開發(fā),延伸黃皮果產(chǎn)業(yè)鏈,為黃皮果的應(yīng)用于食品加工奠定一定的理論基礎(chǔ)。