余婧萍，賀春香，李澤，楊苗，成紹武，宋禎彥

論著·實驗研究

芍藥苷對PINK1-Parkin介導的線粒體自噬在H2O2誘導SH-SY5Y細胞損傷中的影響

余婧萍，賀春香，李澤，楊苗，成紹武，宋禎彥

湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

觀察芍藥苷對過氧化氫（H2O2）誘導的人神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）細胞損傷中線粒體自噬的影響，探討其相關作用機制。采用250 μmol/L H2O2誘導SH-SY5Y細胞24 h構建細胞損傷模型。實驗細胞分為空白組、模型組和芍藥苷低、中、高劑量組。采用MTT法檢測細胞存活率，JC-1線粒體膜電位熒光探針檢測線粒體膜電位，TUNEL染色檢測細胞凋亡率，Western blot檢測PINK1、Parkin、LC3Ⅱ和p62蛋白的表達。與空白組比較，模型組細胞存活率下降，線粒體膜電位下降，細胞凋亡率上升，PINK1、LC3Ⅱ和p62蛋白表達升高，Parkin蛋白表達無明顯變化；與模型組比較，芍藥苷低、中、高劑量組細胞線粒體膜電位上調(diào)，細胞凋亡率下降，PINK1、LC3Ⅱ和p62蛋白表達降低，Parkin蛋白表達升高。芍藥苷可顯著降低H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷，其機制可能與調(diào)控PINK1-Parkin介導的線粒體自噬途徑相關。

芍藥苷；人神經(jīng)母細胞瘤細胞；過氧化氫；線粒體自噬；PINK蛋白；Parkin蛋白；信號通路

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種與年齡相關的致死性神經(jīng)退行性疾病，臨床以進行性的認知、學習、記憶功能障礙為主要特征。目前，全球4700萬人患有AD，預計2050年AD將影響1.35億人[1]。目前臨床對AD的治療手段十分有限，療效欠佳。AD病理組織學特征是不溶性β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）斑塊的胞外聚集和由過度磷酸化的微管相關tau蛋白組成的神經(jīng)原纖維纏結（neurofbrillary tangles，NFTs）的胞內(nèi)聚集。研究表明，氧化損傷是AD的主要特征，可出現(xiàn)在輕度認知功能障礙及Aβ沉積和NFTs形成之前[2]。氧化應激（oxidative stress，OS）是由于活性氧（ROS）及氧化與抗氧化作用失衡引起的。線粒體是細胞中ROS的主要產(chǎn)生部位之一，線粒體容易因基質(zhì)中產(chǎn)生的ROS而引起氧化損傷。AD早期即存在的氧化應激狀態(tài)可損傷線粒體功能[3]，線粒體選擇性降解自噬（線粒體自噬）是大自噬的一種特殊形式，通過選擇性清除受損和功能異常的線粒體，可保護細胞免受過度的氧化應激和細胞死亡。線粒體自噬功能障礙會導致多種神經(jīng)退行性疾病，包括帕金森病和AD[4-5]。因此，探索改善神經(jīng)元線粒體自噬功能障礙的有效藥物，對AD的早期防治具有重要臨床意義。

白芍最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為毛茛科多年生草本植物芍藥的干燥根。芍藥苷為水溶性單萜苷，是白芍的主要有效成分之一。芍藥苷具有抗炎、抗氧化、改善學習記憶能力等藥理作用[6-7]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可通過降低過氧化氫（H2O2）誘導人神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）內(nèi)的ROS水平，改善自噬-溶酶體系統(tǒng)功能，進而改善細胞受損狀態(tài)[8]。但其對線粒體自噬調(diào)控及具體機制還不清楚。本實驗通過研究芍藥苷干預H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷，觀察其對線粒體膜電位、細胞凋亡及PINK1/Parkin信號通路的影響，探討芍藥苷對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷的神經(jīng)保護機制。

1 實驗材料

1.1 細胞

SH-SY5Y細胞株購自中國科學院上海生命科學研究所。用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM-F12（1∶1）培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。待細胞生長至對數(shù)生長期，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化重懸細胞，顯微鏡下細胞計數(shù)，根據(jù)實驗需求接種不同密度的細胞至各孔板中，或?qū)⒓毎麘乙喊?∶3比例接種于新的培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。

1.2 藥物和試劑

芍藥苷（IP0030）、MTT（M8180）、JC-1線粒體膜電位熒光探針（J8030）、胰蛋白酶-EDTA消化液（T1320），中國索萊寶公司；二甲基亞砜（DMSO，D806645），中國麥克林公司；H2O2溶液（323381），美國Sigma公司；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（C1088），中國Beyotime公司；Triton X-100（9002-93-1），中國Beyotime公司；SDS-PAGE蛋白5×上樣緩沖液（P0015L），中國Beyotime公司；RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer，01408/504074），康為世紀生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑混合物（CW2200），康為世紀生物科技有限公司；BCA蛋白定量分析試劑盒（NCI3227CH），美國Thermo Fisher公司；一抗Parkin（#4211），美國CST公司；一抗PINK1（sc-517353），美國SANTA CRUZ公司；一抗p62（ab56416），美國Abcam公司；一抗LC3（bs-8878R），北京博奧森生物有限公司；β-actin（bs-0061R），北京博奧森生物有限公司；山羊抗兔二抗（AP132P），美國Sigma-Aldrich公司；山羊抗小鼠二抗（AP124），美國Sigma-Aldrich公司；10%胎牛血清，美國Gibco公司；1%青霉素-鏈霉素混合液，美國Hyclone公司。

1.3 儀器

ChemiDoc XRS+化學發(fā)光凝膠成像儀，美國BIO-RAD公司；Medifuge?小型臺式離心機、Series 8000 WJ CO2培養(yǎng)箱，美國ThermoFisher公司；Axio Vert.A1倒置熒光顯微鏡，德國ZEISS公司；Cytation3多功能酶標儀，美國BioTek公司；A1+共聚焦激光顯微鏡，日本Nikon公司。

2 實驗方法

2.1 過氧化氫誘導的SH-SY5Y細胞損傷模型制作

參照本課題組前期發(fā)表文獻方法制作SH-SY5Y細胞損傷模型[9]。

2.2 分組

待細胞生長至對數(shù)生長期后，將細胞接種于96孔板（約5×103個/孔）、12孔板（約1×105個/孔）和6孔板（約4×105個/孔），繼續(xù)培養(yǎng)過夜后，給予不同處理，分別設置空白組、模型組（250 μmol/L H2O2）和芍藥苷低（5 μmol/L）、中（10 μmol/L）、高（20 μmol/L）劑量組。

2.3 MTT法檢測細胞活率

96孔板中細胞經(jīng)H2O2、芍藥苷處理一定時間后，吸棄孔中培養(yǎng)液，每孔加入10 μL MTT和90 μL完全培養(yǎng)液，同時設置調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液和MTT，每孔加入100 μL DMSO，振蕩30 s，490 nm波長檢測吸光度（OD值），計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝（實驗組OD值－調(diào)零組OD值）÷（空白組OD值－調(diào)零組OD值）×100%。

2.4 JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位

12孔板中細胞經(jīng)處理后，吸棄培養(yǎng)基，加入工作濃度為1 μg/mL的JC-1熒光探針染液（DMSO配制），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20 min，PBS輕洗細胞3次，使用Axio Vert.A1倒置熒光顯微鏡成像觀察，用Image J軟件計算平均熒光強度。平均熒光強度＝光密度總和÷熒光面積。以紅綠熒光平均熒光強度比值衡量線粒體去極化的比例。

2.5 TUNEL染色檢測細胞凋亡

12孔板中細胞經(jīng)處理后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗細胞1次，4%多聚甲醛固定細胞30 min；PBS洗細胞1次，用0.3%Triton X-100（PBS配制），室溫孵育5 min，PBS輕洗細胞2次；每孔加入50 μL檢測液（含5 μL TdT酶和45 μL熒光標記液）；于37 ℃恒溫箱中避光孵育60 min，PBS洗細胞3次；用含DAPI的抗熒光淬滅封片液封片，鏡下成像觀察染色結果。

2.6 Western blot檢測細胞相關蛋白的表達

6孔板中細胞經(jīng)處理后，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS輕洗3次，吸棄PBS；以5 μL/cm2計算，加入RIPA裂解液；按1∶50比例加入蛋白酶抑制劑；冰上搖晃20 s，用細胞刮子將細胞刮下，將液體和細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中；冰上使用超聲破碎儀，超聲粉碎10 s；15 000×、4 ℃離心10 min，將上清移至新EP管。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，將各組蛋白配制成2 μg/μL上樣緩沖液，100 ℃金屬浴20 min，使蛋白變性，-80 ℃保存。配制丙烯酰胺膠，每孔加30 μg樣品；80 V電泳30 min，100 V電泳120 min；用0.22 μm PVDF膜，200 mA、4 ℃濕轉(zhuǎn)90 min；用5%脫脂牛奶（TBST配制）室溫封閉1 h；按1∶1000稀釋PINK1、Parkin、LC3、p62，按1∶5000稀釋β-actin，4 ℃搖床孵育過夜；吸棄一抗，用TBST洗3次，每次10 min；按1∶10 000稀釋二抗，37 ℃搖床孵育1 h；吸棄二抗，TBST洗3次，每次10 min，按1∶1配制顯影液，用凝膠成像儀成像分析。

3 統(tǒng)計學方法

4 結果

4.1 芍藥苷對過氧化氫誘導的SH-SY5Y細胞存活率的影響

SH-SY5Y細胞存活率受H2O2濃度及作用時間的影響，H2O2濃度越高、作用時間越長，SH-SY5Y細胞存活率越低。當H2O2濃度為250 μmol/L、作用時間為24 h時，細胞存活率約為55%[9]，故本實驗選擇250 μmol/L H2O2誘導24 h建立細胞模型。給予不同濃度芍藥苷干預24 h后，MTT結果顯示，隨著芍藥苷濃度升高并不影響正常細胞的存活率，但濃度為40 μmol/L時會一定程度上影響細胞存活率，見表1。對250 μmol/L H2O2造模的細胞給予不同濃度芍藥苷干預后，SH-SY5Y細胞存活率明顯上升（＜0.05），且有一定的濃度相關性，見表2。根據(jù)MTT檢測結果，選擇低（5 μmol/L）、中（10 μmol/L）、高（20 μmol/L）3個濃度芍藥苷進行后續(xù)實驗。

表1 不同濃度芍藥苷對SH-SY5Y細胞存活率的影響（±s）

表2 不同濃度芍藥苷對H2O2作用SH-SY5Y細胞存活率的影響（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

4.2 芍藥苷對過氧化氫誘導的SH-SY5Y線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位下降是細胞凋亡早期一個重要的標志性事件。JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可反映細胞膜電位的下降，同時也可將這一轉(zhuǎn)變作為細胞凋亡早期的檢測指標。當線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，形成紅色熒光；而當線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時JC-1為單體，形成綠色熒光。通過JC-1熒光探針檢測各組細胞線粒體膜電位，結果顯示，空白組紅色熒光較強，提示線粒體膜電位較高；與空白組比較，模型組綠色熒光與紅色熒光比值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），提示模型組細胞線粒體膜電位下降；與模型組比較，芍藥苷各劑量組綠色熒光與紅色熒光比值降低，提示細胞線粒體膜電位較模型組升高，其中芍藥苷中、高劑量組線粒體膜電位差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。見圖1、表3。

4.3 芍藥苷對過氧化氫誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響

細胞發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA。當基因組DNA斷裂時，暴露的3'-OH可在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下加上綠色熒光探針熒光素標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸，從而可通過熒光顯微鏡進行檢測。結果顯示，與空白組比較，模型組細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與模型組比較，芍藥苷各劑量組細胞凋亡率均降低，芍藥苷中、高劑量組差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。結果見表4、圖2。

4.4 芍藥苷對過氧化氫誘導的SH-SY5Y線粒體自噬相關蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組細胞PINK1、p62和LC3Ⅱ蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；與模型組比較，芍藥苷各劑量組細胞PINK1、LC3Ⅱ和p62蛋白表達降低，Parkin蛋白表達升高，芍藥苷高劑量組差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05）。結果見表5、圖3。

圖1 各組SH-SY5Y線粒體膜電位比較（JC-1熒光探針，×200）

表3 各組SH-SY5Y線粒體膜電位比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

表4 各組SH-SY5Y細胞凋亡率比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

圖2 各組SH-SY5Y細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×100）

表5 各組SH-SY5Y p62、LC3Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

注：A.空白組；B.模型組；C.芍藥苷低劑量組；D.芍藥苷中劑量組；E.芍藥苷高劑量組

5 討論

有研究表明，芍藥苷可改善AD腦內(nèi)神經(jīng)炎癥與抑制核因子-κB向核的轉(zhuǎn)運和促炎癥因子的轉(zhuǎn)錄有關[10]，還可抑制AD轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ負荷、Aβ誘導的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的過度激活[11]。另外，芍藥苷還可減輕H2O2誘導的細胞氧化損傷作用，與JAK2/STAT3和ERK1/2信號通路有關[12]。前期研究結果顯示，大量ROS在細胞內(nèi)聚集會導致細胞損傷[13]。嚴重的氧化應激損傷可引發(fā)細胞內(nèi)程序性死亡，導致細胞凋亡甚至死亡[14]。AD早期存在線粒體功能紊亂，線粒體功能紊亂會導致細胞代謝、鈣離子平衡失調(diào)，同時也會導致氧化應激增多，最終導致細胞凋亡[12]。線粒體功能異常，以及相關的氧化應激改變是AD患者大腦中神經(jīng)元受損最早出現(xiàn)且最突出的特征[15-16]。此外，研究表明，AD患者成纖維細胞在損傷后線粒體膜電位恢復較慢，溶酶體和自噬途徑發(fā)生改變，ROS聚集，這些改變可通過Parkin的過表達來挽救[17]，但其在神經(jīng)細胞中的改變及機制仍需進一步闡明。本實驗結果顯示，芍藥苷可恢復H2O2誘導的SH-SY5Y線粒體膜電位下降，改善線粒體的功能； TUNEL染色結果顯示，芍藥苷可抑制SH-SY5Y細胞凋亡，對改善先于Aβ沉積及NFTs的形成之前就存在的氧化應激對細胞造成的影響具有重要意義。此外，線粒體膜電位的喪失可作為線粒體自噬的線索[18]。H2O2損傷的SH-SY5Y細胞自噬溶酶體功能受損，而芍藥苷可促進其自噬溶酶體的形成，改善自噬受損。線粒體膜電位降低雖能激活線粒體自噬，但我們認為，氧化損傷條件下的SH-SY5Y細胞自噬溶酶體功能受損可能影響線粒體自噬，阻礙受損線粒體的降解過程。

線粒體自噬在AD受損線粒體的降解中起重要作用[19-20]，自噬溶酶體系統(tǒng)功能異常導致受損線粒體降解不足[21]；反之，線粒體功能障礙也可能損害該途徑。PINK1是一種線粒體的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過激活PINK1/Parkin介導的線粒體自噬，對線粒體功能障礙和細胞凋亡具有保護作用[22-23]。Parkin是一種胞質(zhì)的E3泛素連接酶，在線粒體的降解中起重要作用。PINK1與Parkin相互作用是線粒體質(zhì)量控制的基礎[24]，線粒體電位喪失可激活線粒體自噬[25-26]。當線粒體膜電位降低后，PINK1會積累在線粒體外膜上[27]，隨后將Parkin募集到線粒體外膜，泛素化存在于線粒體膜中的Mfn2蛋白，防止受損的線粒體與健康的線粒體融合，最終通過p62蛋白與LC3結合，使線粒體降解。本研究結果表明，芍藥苷干預后，H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷Parkin表達升高，PINK1、LC3Ⅱ、p62表達降低。此外，本課題組前期實驗結果也表明，芍藥苷可通過降低LC3Ⅱ表達，促進p62蛋白降解而調(diào)節(jié)H2O2損傷后SH-SY5Y細胞自噬水平。因此，我們認為，H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷PINK1表達升高是因為該蛋白在細胞內(nèi)蓄積，并非合成增多；芍藥苷對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用，是通過提高Parkin的表達水平來促進PINK1將Parkin募集到受損的線粒體，促進受損線粒體的降解。因此，PINK1水平降低，Parkin水平升高。

本研究使用H2O2誘導SH-SY5Y為細胞模型，通過MTT法確定細胞損傷的適宜濃度與時間點確定模型條件[9]。結果顯示，H2O2濃度為250 μmol/L、作用時間為24 h時，細胞存活率約為55%，該濃度下細胞線粒體膜電位降低，細胞凋亡率增加。芍藥苷干預后，細胞線粒體膜電位有所恢復，細胞凋亡得以抑制，Parkin表達升高，PINK1、LC3Ⅱ和p62表達降低；提示芍藥苷對SH-SY5Y氧化應激損傷有治療作用。因此，我們認為，芍藥苷可降低H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷，通過過表達Parkin蛋白，促進PINK1與Parkin的結合來調(diào)控線粒體自噬，恢復線粒體膜電位，抑制細胞凋亡，改善細胞受損狀態(tài)。

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Effects of Paeoniflorin on PINK1-Parkin Mediated Mitophagy in H2O2-induced SH-SY5Y Cell Damage

YU Jingping, HE Chunxiang, LI Ze, YANG Miao, CHENG Shaowu, SONG Zhenyan

To explore the regulatory effects of paeoniflorin on mitophagy in H2O2-induced SH-SY5Y cell damage; To discuss its mechanism of action.250 μmol/L H2O2was used to induce SH-SY5Y for 24 h to construct a cell injury model. The blank group, model group and paeoniflorin low-, medium- and high-dosage groups were involved in the experiment. Methyl thiazolyl tetrazolium assay was used to detect cell survival rate. JC-1 mitochondrial membrane potential fluorescent probe was used to detect mitochondrial membrane potential. TUNEL staining was used to detect apoptosis rate. Western blot was adopted to detect the protein expression levels of PINK1, Parkin, LC3Ⅱ and p62.Compared with the blank group, the cell survival rate of the model group decreased; the mitochondrial membrane potential decreased; the apoptosis rate increased; the expressions of PINK1, LC3Ⅱ and p62 protein increased; the expression of Parkin protein did not change significantly. Compared withmodel group, the mitochondrial membrane potential of paeoniflorin low-, medium- and high-dosage groups increased; the apoptosis rate decreased; the expressions of PINK1, LC3Ⅱ and p62 proteindecreased;the expression of Parkin proteinincreased.Paeoniflorin can significantly reduce H2O2-induced SH-SY5Y cell damage, and the mechanism of action may be related to the regulation of PINK1-Parkin-mediated mitophagy pathway.

paeoniflorin; SH-SY5Y; hydrogen peroxide; mitochondrial autophagy; PINK1; Parkin; signal pathway

R285.5

A

1005-5304(2020)11-0045-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004479

國家自然科學基金面上項目（81774129）；湖南省自然科學基金（2018JJ2296、2019JJ50441）；湖南省中醫(yī)藥管理局科研項目（2018025）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年科研項目（18B246）

宋禎彥，E-mail：songzhenyan2013@hnucm.edu.cn

（2020-04-20）

（2020-04-29；編輯：華強）