潘建波

（柳州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心廣西柳州 545001）

鵝副粘病毒病是由鵝副粘病毒（Gooseparamyxovirus，GPMV）引起的一種以消化道病變?yōu)樘卣鞯膫魅静　＜毙圆±屠^發(fā)感染的患鵝死亡較多，慢性病例多引起鵝軟腿無(wú)力，慢慢消瘦，縮頭呆立。日齡越小，發(fā)病率和死亡率越高，傳染源主要是病鵝或病愈后帶毒的鵝[1]。由于鵝為群體飼養(yǎng)，又屬水禽，一旦發(fā)生傳染病就會(huì)迅速傳播、污染面很廣難以控制，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。鵝副粘病毒病對(duì)鵝的危害較大，雛鵝染病后死亡率通常在90%以上，常在發(fā)病后1～2d 內(nèi)死亡，成鵝一般在發(fā)病后3～5d 死亡，給養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展帶來(lái)了巨大的影響[2,3]，該病尚無(wú)特效治療的藥物，通過(guò)控制引種、做好消毒劑、制定合理的免疫計(jì)劃，可有效預(yù)防該病的流行與發(fā)生。本研究從送檢的病料中成功分離鑒定一株鵝副粘病毒，為后續(xù)的鵝副粘病毒病新型疫苗的研制及流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

9～10 日齡SPF 雞胚購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司，一步法RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒、鵝副粘病毒陽(yáng)性血清、禽流感病毒（H5 亞型）與禽流感病毒（H9 亞型）陽(yáng)性血清均購(gòu)置山東濟(jì)南承森貿(mào)易有限公司。

1.2 病料處理

取廣西柳州某發(fā)病鵝場(chǎng)送檢的鵝，進(jìn)行解剖后取病變組織，加入3～5 倍體積的滅菌的磷酸鹽緩沖液研磨，凍融2 次，12,000rpm 離心10min，取上清液加入青、鏈霉素，4℃作用4～5h后，12,000 rpm 離心5min，取上清液經(jīng)0.45μm 濾膜過(guò)濾除菌，樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒分離

將上述待樣品接種9～10 日齡SPF 雞胚，接種量為0.1mL/胚，棄去24h 內(nèi)死亡雞胚，逐日觀察至120h，取雞胚尿囊液繼續(xù)接種9～10 日齡SPF 雞胚，傳至3 代。

1.4 血凝及血凝抑制試驗(yàn)

取收獲的第3 代雞胚尿囊液，按常規(guī)血凝試驗(yàn)操作方法進(jìn)行分離病毒的血凝（HA）、血凝抑制試驗(yàn)（HI）的測(cè)定，分別用副粘病毒、禽流感病毒（H5 亞型）、禽流感病毒（H9 亞型）陽(yáng)性血清對(duì)分離病毒進(jìn)行血凝抑制測(cè)定。

1.5 RT-PCR 鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)合成引物F1：5'-GCCGAATTCCCGAATCATCACGACGCTTAA-3'；F2：5'-GTGAAGCTTGAGTCTGTGAGTCGTAC-3'[4]。

采用一步法RT-PCR 擴(kuò)增方法對(duì)待分離病毒樣品進(jìn)行RT-PCR鑒定。PCR 反應(yīng)程序設(shè)置為：50℃15min；94℃30s，退火溫度為55℃45s，72℃下延伸時(shí)間為45s，30 個(gè)循環(huán)；72℃5min，PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離

處理后的組織樣品尿囊腔接種于9～10 日齡SPF 雞胚，至第2 代開(kāi)始出現(xiàn)規(guī)律性死亡，死亡時(shí)間在接種后48～60h 之間。收獲第3 代含毒雞胚尿囊液于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HA、HI 測(cè)定結(jié)果

按常規(guī)方法對(duì)收集的第3 代尿囊液毒進(jìn)行了雞紅細(xì)胞血凝測(cè)定，血凝效價(jià)為1:512；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，該毒株的血凝效價(jià)可以被副粘病毒陽(yáng)性血清所抑制，而與H5 亞型禽流感病毒、H9 亞型禽流感病毒陽(yáng)性血清不發(fā)生抑制反應(yīng)。

2.3 RT-PCR 鑒定結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測(cè)，在位于約970bp處可見(jiàn)特異性目的DNA 擴(kuò)增條帶（圖1），陰性對(duì)照未有任何擴(kuò)增，與文獻(xiàn)的報(bào)道一致。

3 討論

近年來(lái)，隨著我國(guó)鵝的飼養(yǎng)數(shù)量和生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，鵝副粘病毒病早已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要疾病之一，國(guó)內(nèi)已有眾多學(xué)者對(duì)病原體進(jìn)行了分離鑒定及一系列相關(guān)研究，張偉等[5]于2010 年從梁山縣一養(yǎng)鵝場(chǎng)病死鵝中分離出一株疑似鵝副粘病毒，通過(guò)血凝抑制實(shí)驗(yàn)及PCR 鑒定最終確定為鵝副粘病毒，命名為L(zhǎng)S-1，并對(duì)其致病性進(jìn)行了相關(guān)研究；黃宇翔等[6]于2018 年從疑似鵝副粘病毒感染致死的鵝肝臟和脾臟中成功分離到了一株鵝副粘病毒；杜宗沛等[7]于2013 年從江蘇泰州市某鵝場(chǎng)分離到一株高致病性鵝副粘病毒，其分離株經(jīng)滅活處理后免疫鵝群，取到了良好的免疫效果。本文成功分離鑒定了一株鵝副粘病毒，為發(fā)病鵝場(chǎng)查明了致病原因，為養(yǎng)鵝場(chǎng)第一時(shí)間制定出綜合防治措施提供了依據(jù)，同時(shí)為鵝副粘病毒病新型疫苗的研究及流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支持。盡管該養(yǎng)殖場(chǎng)已經(jīng)免疫過(guò)疫苗，但很可能因?yàn)轱曫B(yǎng)密度過(guò)大、環(huán)境條件差等一系列原因?qū)е旅庖呤?，可?jiàn)疫病的成功防控需要綜合考慮到各個(gè)細(xì)節(jié)。█

圖1 分離毒RT-PCR 電泳檢測(cè)