米運宏，梁 鵬，藍伯廣

(1南寧縱聯(lián)科技有限公司，廣西南寧530033；2廣西本草坊保健品有限公司，廣西南寧530007)

0 引言

蔗糖酶(Sucrase)[1]也稱蔗糖轉(zhuǎn)化酶(invertase)[2]或 β-D-呋喃果糖苷水解酶(β-D-fructofuranoside fructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特異地催化非還原糖中的β-D-呋喃果糖苷鍵水解，能催化蔗糖水解生成等量葡萄糖和果糖[3]，稱之為轉(zhuǎn)化糖漿[4]。蔗糖水解成果糖和葡萄糖可以通過酸水解[5]或蔗糖酶水解[6]。酸水解需要添加酸性物質(zhì)如檸檬酸鈉、鹽酸、硫酸等至蔗糖溶液中使pH值降至2～3，再經(jīng)過高溫保壓使蔗糖水解。在高溫高壓下蔗糖水解成果糖和葡萄糖，同時糖也發(fā)生美拉德反應(yīng)，導致轉(zhuǎn)化糖液色澤較深，在后工序中需要增加脫色、脫鹽、濃縮等工藝。雖然酸水解中時間較短，但是從整個生產(chǎn)來說時間并沒有縮短，反而造成生產(chǎn)操作復雜化等不足。因此，在實際生產(chǎn)中用蔗糖酶液或凍干蔗糖酶，兩者均為游離酶，游離蔗糖酶用于轉(zhuǎn)化蔗糖反應(yīng)結(jié)束后需要要滅酶，且僅能用1次，而把游離蔗糖酶固定于特定載體中獲得固定化蔗糖酶[7-8]，用于轉(zhuǎn)化蔗糖反應(yīng)完全只需把固定化蔗糖酶回收，不用滅酶，因此，固定化蔗糖酶可重復使用，直至固定化蔗糖酶活性降低到不再適合使用為止[9]。蔗糖(白砂糖)是歷史悠久的最常用的甜味劑之一[10]，清甜純正，無不良感或甜膩感。白砂糖主要以結(jié)晶體形式在市場上銷售，除了保存和運輸方便外，使用中存在許多不便，日常烹飪中添加白砂糖調(diào)節(jié)菜品的口味或色澤，溶解時間長、著色不均、局部容易焦化等不足，白砂糖以調(diào)甜味加到如奶茶、涼茶不容易溶解，在飲料工廠加入白砂糖需要加熱攪拌溶解，增加了能耗等。此外，目前使用玉米源高果糖漿存在對人體健康的風險[11]，為為了克服白砂糖此類使用不足和滿足市場細細分需要，市場上出現(xiàn)月餅專用標準糖漿(燒烤糖漿、 烹 飪 糖漿、奶茶專用糖漿、調(diào)味糖漿)[12-13]、甘 蔗 糖漿[14-15]、冰糖漿等等，而此類糖漿含有一定量的蔗糖成分，不能完全用淀粉糖漿如玉米源高果糖漿[16-17]、麥芽糖漿代替。但蔗糖源高果糖漿銷售價格比淀粉源果葡糖漿貴將近一倍。除了生產(chǎn)原料白砂糖價格高之外，生產(chǎn)成本高也導致致蔗糖源高果糖漿價格偏高。為了提高蔗糖源果葡糖漿競爭力，利用固定化蔗糖酶法生產(chǎn)蔗糖源果葡糖漿對降低產(chǎn)品成本效果顯著，且優(yōu)點明顯：首先工藝上減少滅酶、脫色能耗；其次固定化蔗糖酶可重復使用，減少酶的的成本；最后是產(chǎn)品質(zhì)量比較純凈、、保持產(chǎn)品色香味、甜度增厚，不容易結(jié)晶[18]。而固定化蔗糖酶生產(chǎn)蔗糖源果葡葡糖漿的關(guān)鍵是蔗糖酶固定化技術(shù)[19]和固定化蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖[20]的控制參數(shù)，本文主要介紹固定化蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)蔗糖源果葡糖漿的控控制參數(shù)的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

優(yōu)質(zhì)白砂糖(南南寧糖業(yè)明 陽糖廠)、乙腈腈(色譜純，天津四友)、固定化化蔗糖酶(自制，活力為2..5萬U/g)、試驗反應(yīng)罐(OK-10 L，浙江新歐科)，驗證試驗反應(yīng)罐(TR08-1000 L，江蘇天宇)、板框過濾機((WBG-1200 mm，廣州恒東機械)，超高溫瞬時滅菌器(RD 6L10，北京東方海川)、二效真空濃縮器(SJN-100000，溫州成東藥機)、直線灌裝機(GTL--4，山東青州膏體達)、反滲透純水機(HCC-1000，北京京東方海川)、高效液相色譜儀(LA100，日本島津,示差檢測器)、工作站(N20000，浙江大學)、旋振分離篩(TS-12000，河南新鄉(xiāng)天豐振動機械)。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程[21--23]

固定化蔗糖酶法制備蔗糖源高果糖漿的工藝流程見圖1。

圖1 固定化蔗糖酶法制備蔗糖源高果糖漿工藝流程圖

1.2.2 反應(yīng)設(shè)備技技術(shù)參數(shù)

單因素試驗驗設(shè)備采用1000 L不銹鋼反應(yīng)罐，徑高比為為5/9，葉片式攪拌漿，攪拌不可調(diào)轉(zhuǎn)速為1200 r/minn，夾套導熱油保溫，溫度差可控±0.5℃，反應(yīng)裝料量為75 L；驗證試驗設(shè)備采用10000 L不銹鋼反反應(yīng)罐，徑高比 55/9，葉片式攪拌漿，攪拌變頻調(diào)速120 r/mmin，夾套保溫，溫差可控±0.5℃，，反應(yīng)加料量為7750 L。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.11 固定化酶用量對轉(zhuǎn)化率的影響

固定化蔗糖酶用量分別為0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%、0.55%、0.6%，溫度50℃，pH 5.0，底物濃度(蔗糖液濃度)50%，反應(yīng)時間8 h進行試驗。

1.2.3.2 溫度變化對轉(zhuǎn)化率影響

反應(yīng)溫度分別為 40、45、50、55、60、65、70、75、80℃，pH 5.0，底物濃度50%，反應(yīng)時間8 h，固定化酶用量0.25%進行試驗。

1.2.3.3 pH變化對轉(zhuǎn)化率影響

反應(yīng)pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，溫度50℃，底物濃度50%，反應(yīng)時間8 h,固定化蔗糖酶用量0.25%進行試驗。

1.2.3.4 反應(yīng)底物濃度變化對轉(zhuǎn)化率影響

底物濃度分別為45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%，其它影響因素溫度50℃，pH 5.0，固定化蔗糖酶用量0.25%，反應(yīng)時間8 h進行試驗。

1.2.3.5 反應(yīng)時間變化對轉(zhuǎn)化率影響

反應(yīng)時間為 4、6、8、10、12、14、16、18 h，溫度50℃，pH 5.0，底物濃度50%，固定化蔗糖酶用量0.25%進行試驗。

1.2.4 響應(yīng)面試驗

利用Design-Expert 7.0中軟件Box-Behnken設(shè)計與分析，根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定固定化蔗糖酶添加量(A)、反應(yīng)溫度(B)、pH(C)、反應(yīng)底物濃度(D)、反應(yīng)時間(E)為因素水平取值范圍，并以這5個因素為自變量，以轉(zhuǎn)化率R1為響應(yīng)值，利用Box-Behnken模型設(shè)計5因素3水平試驗組作響應(yīng)面分析，因素水平值見表1。

表1 試驗因素及水平值

1.2.5 轉(zhuǎn)化率計算

式 1中葡萄糖(G)、果糖(F)和蔗糖(GF)是指反應(yīng)轉(zhuǎn)化結(jié)束后的轉(zhuǎn)化液用高效液相測得的數(shù)據(jù)。試驗試劑和檢測方法按中華人民共和國國家標準GB/T 20882-2007《果葡糖漿》規(guī)定方法[24-25]。

1.2.6 驗證方法

每次反應(yīng)驗證都用同一批次新的固定化蔗糖酶，其它控制反應(yīng)參數(shù)經(jīng)過優(yōu)化獲得的數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束把固定化蔗糖酶回收，反應(yīng)液經(jīng)過瞬時滅菌后，取樣用高效液相色譜儀檢測轉(zhuǎn)化率。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

按要求所得的數(shù)據(jù)，運用軟件Design-Expert 7.0進行模型設(shè)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 固定化酶用量對轉(zhuǎn)化率影響

固定化蔗糖酶用量對轉(zhuǎn)化率的影響見圖2。由圖2可以看出，在反應(yīng)時間、pH、底物濃度、溫度不變，改變添加固定化蔗糖酶的用量，隨添加量增加，轉(zhuǎn)化率隨之快速提高，從酶用量0.1%時轉(zhuǎn)化率為83%，到0.15%時轉(zhuǎn)化率94%幾乎是直線上升，從 0.15%～0.2%轉(zhuǎn)化率升高有所放緩，轉(zhuǎn)化率從94%升至97%，只升高3%，0.2%～0.3%緩慢上升，酶用量到 0.3%～0.4%時轉(zhuǎn)化率只升高 0.4%。添加量為 0.4%以上時，轉(zhuǎn)化率升高 1%以下。從經(jīng)濟角度考慮，酶添加量應(yīng)該選用0.3%～0.4%之間比較合理。

2.1.2 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

溫度變化是生物酶反應(yīng)最主要因素之一，在酶耐受溫度內(nèi)，溫度每變化10℃，酶反應(yīng)速率提高1～3倍，具體試驗見圖3。

從圖3看出，反應(yīng)溫度40～60℃轉(zhuǎn)化率處于上升階段，40～50℃轉(zhuǎn)化上升較快從76%快速升96%，而反應(yīng)溫度50～60℃，轉(zhuǎn)化率從96%升到99.7%。反應(yīng)溫度超過60℃轉(zhuǎn)化率開始下降，溫度在60～65℃轉(zhuǎn)化率下降緩慢，超過溫度65℃轉(zhuǎn)化率有了較快下降，反應(yīng)溫度在75～80℃轉(zhuǎn)化率急速下降，轉(zhuǎn)化率從86%快速降到53%。反應(yīng)溫度在隨溫度升高，酶反應(yīng)開始向最適溫度靠近，所以轉(zhuǎn)化率在上升階段，當反應(yīng)溫度升到60℃左右，轉(zhuǎn)化率最高說明接近最適適反應(yīng)溫度，溫度繼續(xù)升高，轉(zhuǎn)化率開始下降，說明反反應(yīng)溫度超過酶解最適反應(yīng)溫度，超過溫度越高，轉(zhuǎn)化率下降越快，高溫對酶活性有抑制或殺滅。圖3可看出固定化蔗糖酶對溫度是敏感的，生產(chǎn)上考慮選取的反應(yīng)溫度應(yīng)該在55～65℃。

2.1.3 反應(yīng)pH值對轉(zhuǎn)化率的影響

圖2 固定化蔗糖酶不同用量對轉(zhuǎn)化率的影響

圖3 不同反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化率影響

考查固定化蔗糖酶轉(zhuǎn)化化蔗糖受到反應(yīng)系統(tǒng) pH變化對反應(yīng)影響情況結(jié)果見圖4。

圖4在pH 33.5時轉(zhuǎn)化率率79%，一直直平緩上升至至pH 55.5，轉(zhuǎn)化率99.8%，當pH值繼續(xù)升升高至6.5，轉(zhuǎn)化率率降到83%%，pH值越高，轉(zhuǎn)化率下降幅度較大，，當pH升至8轉(zhuǎn)化率僅為41%。從曲線圖4可得pH在5～～5.5區(qū)間為最適反應(yīng)pH值，pH 3.5～5.5為酸酸性區(qū)，pH值高于5.5之后，轉(zhuǎn)化率下降比較快，pH為7中性時轉(zhuǎn)化率為74%，很明顯固定定化蔗糖酶具有耐低pH值，綜合考慮選取反應(yīng)pH在5～6區(qū)間。

2.1.4 反應(yīng)底物濃濃度對轉(zhuǎn)化率率的影響

固定化蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖中僅改變蔗糖濃度，其它因素為溫度 500℃，pH 5..0 固定化蔗糖酶用量0.25%，反應(yīng)時間8 h影響情況見圖5。

從從圖5中可以看出蔗糖濃度在 50%%轉(zhuǎn)化率為99.8%，到蔗糖濃度為70%時轉(zhuǎn)化率為877.5%，蔗糖濃度超過70%時，固定蔗糖酶酶轉(zhuǎn)化率開始始呈快速下降趨勢，蔗糖濃度75%時轉(zhuǎn)化化率70%，蔗糖濃度為85%，轉(zhuǎn)化率為 334%。轉(zhuǎn)化率隨蔗糖濃度升高，轉(zhuǎn)化率隨之下降，是由于蔗糖濃度升高，反應(yīng)體系中的黏度也升高，進而影響了酶分子運動，導致酶解反應(yīng)速度變慢。從能耗大小考慮，應(yīng)該選擇底物濃度在65%～75%之間。

2.1.5 反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響

圖4 不同反應(yīng)pH值對轉(zhuǎn)化率的影響

圖5 反應(yīng)底物不同濃度對轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)溫度 50℃、pH 55.0 固定化蔗糖酶用量0.25%，反應(yīng)液中蔗糖濃度50%，反應(yīng)時間為4、6、8、10、12、14、16、18 h試驗結(jié)果見圖6。

從圖6看出反應(yīng)時間4～8 h轉(zhuǎn)化率曲線很陡，，之后一直平穩(wěn)。說明 4～8 h反應(yīng)還沒有轉(zhuǎn)化完全，故轉(zhuǎn)化率一直上升階段。8～18 h轉(zhuǎn)化率變化不大，說明反應(yīng)已經(jīng)達到或處于平衡階段。酶促促反應(yīng)時間應(yīng)選在在 8～12 h。

2.2 響應(yīng)面面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)應(yīng)面優(yōu)化試驗

利用BBox-Behnkeen模型設(shè)計試驗組作響應(yīng)面分析，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表3可看出模型極顯著(P＜0.0001)，說明5個因素變量與轉(zhuǎn)化率之間的線性關(guān)關(guān)系顯著。失擬合項P=0.0942＞0.05，不顯著，說明本試驗所得得二次回歸方程能能很好地對響響應(yīng)值進行預預測。試驗值值與回歸方程預測值的相關(guān)系數(shù)R2為0.99798，說明該該模型能解釋97.98%響應(yīng)值的的變化，只有有2.12%不能能用此模型解釋，擬合情況很很好。校正擬合度AdjjR2為0.9637和預測擬合度PrredR2為0.9230，兩者數(shù)數(shù)字相近且數(shù)值較大接近 1，說明該模型型具有較好的的回歸性。變異系數(shù)數(shù)(CV)表示試試驗的精確度度，其數(shù)值越越小，試驗結(jié)果的可靠性越高高。

圖6 不不同反應(yīng)時間對對轉(zhuǎn)化率的影響

表2 響應(yīng)面試驗驗設(shè)計與結(jié)果

試驗號 酶用量(%) 反應(yīng)溫度(℃) pH 底物濃度(%) 反應(yīng)時間(h) 轉(zhuǎn)化率(%)33 -1 0 0 1 0 87.5 34 0 0 0 0 0 96.8 35 0 0 0 0 0 97.1 36 0 0 1 0 1 96.9 37 1 0 0 1 0 90.2 38 1 -1 0 0 0 98.1 39 0 0 -1 -1 0 98 40 0 -1 0 0 -1 97.2 41 0 0 0 0 0 97.7 42 0 1 1 0 0 97.4 43 -1 1 0 0 0 96.8 44 -1 0 -1 0 0 95.9 45 1 0 0 0 -1 97.6 46 0 1 0 -1 0 96.3

表3 響應(yīng)值模型方差分析

本試驗 CV為 0.76%，在可接受范圍內(nèi)說明試驗結(jié)果可靠很高[26-27]。從回歸方程系數(shù)顯著性可知，一次項A、D、E極顯著，互交項 BD及二次項D2表現(xiàn)為顯著。由F值大小可得出各因數(shù)影響大小，依次為底物濃度(D)＞添加酶量(A)＞反應(yīng)時間(E)＞反應(yīng)溫度(B)＞pH(C)。經(jīng)回歸擬合后得到二次多項式編碼回歸方程：轉(zhuǎn)化率(%)(Y)=97.37+0.97A+0.26B-0.25C-4.79D+0.49E-0.40AB+0.20AC+0.35AD+0.12AE+0.23BC+0.78BD-0.17BE-0.27CD-0.70CE+0×DE+0.25A2-0.31B2-0.36C2-4.82D2-0.11E2。

圖7是BD互交項為顯著項的所得到的二次回歸方程的R1響應(yīng)面3D圖。圖底部等高線及曲面形狀反映交互作用大小，當為橢圓形時，表示交互作用顯著，而圓形則表示交互作用不顯著[28]。

2.3 響應(yīng)面面優(yōu)化最佳控控制參數(shù)

經(jīng)過軟軟件分析，設(shè)設(shè)置軟件響應(yīng)值(轉(zhuǎn)化率率)達到最大化(maaximize)[29]，模型運行預測得到最佳控制參數(shù)：酶用量0.4%，反應(yīng)溫度588.36℃，pH5.13，底物濃度66.9%，反應(yīng)應(yīng)時間12.82 h。響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果見圖8～10三維效果圖。

圖8～10是在最佳條件的情況下，影響最大因素底物濃度和影響第2位因素的3D效果圖，由圖可見等高線互交作用顯著，響應(yīng)曲面的傾斜度較高，顏色也由淺藍色漸變深綠色，說明交互作用顯著。

圖7 互交項BD響應(yīng)面三維圖

圖8 最佳條件下下BD互交項轉(zhuǎn)化率3D效果和等高線圖

圖9 最佳條件AD互交項3D效果和等高線圖

圖10 最佳條件下BD互交項3D效果和等高線圖

2.4 模模型驗證

根據(jù)優(yōu)化得到操作參數(shù)：添加酶量(A)0.4%，反應(yīng)溫度(B)58.36℃℃，pH(C)5.13，底物濃度(D)66.9%，反應(yīng)時間(E)13.115 h，按實際操作修改為添加酶量(A)0.4%，反應(yīng)溫度(B)58.4℃℃，pH(C)5.11，底物濃度(D)677%，反應(yīng)時間(E)13 h。驗證檢測結(jié)果可見圖11～13。

由表4～6可以看出反應(yīng)液中果糖、、葡萄糖、蔗糖含量，表4果糖、、葡萄糖、蔗糖糖含量分別為49.61%、48.34%%，2.05%，由此可計算出第一次驗證的轉(zhuǎn)化率為97..95%；表5果糖、葡萄糖、蔗糖含量為別為51.43%、47.19%，1.38%，計計算出第 2次次驗證的轉(zhuǎn)化率為為98.62%；表6果糖、葡萄糖、蔗糖含量為別為50.44%、48.20%，1.36%，計算得第3次驗證的轉(zhuǎn)化率為98.65%；；平均轉(zhuǎn)化率為98.41%，與軟件預測轉(zhuǎn)化化率接近，說明模型預測可靠。

圖11 第一次驗證反應(yīng)分離液的高效液相譜圖

圖12 第二次驗證反應(yīng)分離液的高效液相譜圖

圖13 第三次驗證反應(yīng)分離液的高效液相譜圖

表4 第一次驗證反應(yīng)分離液的高效液相峰面積分結(jié)果

表5 第二次驗證反應(yīng)分離液的高效液相峰面積積分結(jié)果

表6 第三次驗證反應(yīng)分離液的高效液相峰面積積分結(jié)果

3 結(jié)論與展望

⑴通過優(yōu)化試驗，得到固定化蔗糖酶轉(zhuǎn)化蔗糖最佳控制參數(shù)：酶用量 0.4%，反應(yīng)溫度 58.36℃，pH 5.13，底物濃度66.9%，反應(yīng)時間12.82 h，并可應(yīng)用到實際生產(chǎn)中酶解工序中。

⑵蔗糖源高果糖漿是專用標準糖漿，可根據(jù)用戶的需要糖漿中各糖分含量的比例，通過控制轉(zhuǎn)化反應(yīng)參數(shù)加以實現(xiàn)，企業(yè)可從傳統(tǒng)產(chǎn)品統(tǒng)一標準生產(chǎn)方式轉(zhuǎn)向定制式生產(chǎn)模式。

⑶實際生產(chǎn)中所考慮的最主要因素之一是經(jīng)濟效益，按生產(chǎn)工藝過濾、滅菌、濃縮等重要工序，初步制得固形物為70%的成品，按白砂糖價格6000元/t計算，把能源費、人工費、包裝費等費用計算在內(nèi)，測算直接生產(chǎn)成本約5400元/t，而淀粉源高果糖漿的市場價格在3000元/t左右。為蔗糖源高果糖漿產(chǎn)品贏得市場競爭，把蔗糖源高果糖漿進一步升級，與其它食品配料因子復配成各類調(diào)味糖漿、調(diào)甜糖漿、專用糖漿等，另外，從原料上可以選用冰糖母液、制高純度低聚果糖副產(chǎn)物、甘蔗汁等為原料，把蔗糖源高果糖漿的成本進一步降低，提高產(chǎn)品競爭力。

⑷生產(chǎn)工藝的各關(guān)鍵控制點進行研究分析，重點將是把各項工序中控制參數(shù)納入研究分析體系，然后選擇合適分析方法，獲得制備蔗糖源高果糖漿最高經(jīng)濟收益的全部生產(chǎn)工藝參數(shù)。