趙婉茹,謝煜萍,王際輝,王 晗,*(.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 604;.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 604;.東莞理工學(xué)院化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院,廣東東莞 5808)

共軛脂肪酸(conjugated fatty acids,CFA)是一類具有共軛雙鍵的脂肪酸異構(gòu)體,常見的共軛脂肪酸有共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)和共軛亞麻酸(conjugated linoleinc acid,CLnA),具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂代謝、提高免疫力等功效[1-6]。CLnA是一類共軛十八碳三烯酸的異構(gòu)體,與CLA相比具有更強(qiáng)的生物活性[7-8]。β-桐酸即反9、反11、反13-十八碳三烯酸(t9、t11、t13-18∶3)主要存在于桐油中,少量存在于梓樹籽油和苦瓜籽油中。其具有全反式共軛雙鍵,比非全反式的α-桐酸具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性[7,9]。有研究發(fā)現(xiàn),β-桐酸對(duì)結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞、膀胱癌T24細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用[9-10]。但是,目前β-桐酸對(duì)人絨毛膜上皮癌細(xì)胞的作用尚不明確。

人絨毛膜上皮癌是一種來源于胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的惡性腫瘤,病發(fā)人群主要是處于生育年齡期的婦女,發(fā)病快,轉(zhuǎn)移范圍廣,死亡率高[11-15]。目前的治療方法以化療為主,手術(shù)為輔,雖然能夠使病情得到改善,致死率降低,然而化療副作用大,且患者容易對(duì)化療藥產(chǎn)生耐藥性[16]。而食品來源的活性物質(zhì)具有毒副作用小等特點(diǎn),因此,研究苦瓜籽油等來源的β-桐酸對(duì)絨癌細(xì)胞凋亡的影響,可以為絨癌的輔助治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

ROS的產(chǎn)生在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[17-21]。ROS水平的降低,會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤生長(zhǎng)[22-23]。多數(shù)源自天然產(chǎn)物的抗腫瘤化合物可通過升高ROS水平誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[24-25]。因此,ROS可以作為抗癌輔助研究的重要突破口[26]。因此,本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的絨癌JEG-3細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分析了β-桐酸處理對(duì)JEG-3細(xì)胞凋亡的影響,并初步探討了β-桐酸誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡與ROS產(chǎn)生的關(guān)系,為β-桐酸作為功能性食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-桐酸(純度≥98%) 瑞典Larodan Fine Chemicals股份有限公司;人絨毛膜上皮癌JEG-3細(xì)胞 中國科學(xué)院上海細(xì)胞所;DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基 賽默飛世爾生物化學(xué)制品公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) 英國Gibco公司;胰蛋白酶 美國Invitrogen公司;四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、α-亞麻酸 美國Sigma公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;抗β-actin、抗Bcl-2、抗Bax鼠單克隆抗體、抗Caspase-3兔多克隆抗體 美國Santa Cruz生物技術(shù)公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 北京中衫生物公司;2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,H2DCFDA)活性氧標(biāo)記、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-Cysteine,NAC)、Annexin V/PI凋亡試劑盒 江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

CO2恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋電機(jī)株式會(huì)社;酶標(biāo)儀 芬蘭Thermo Fisher公司;流式細(xì)胞儀 美國貝克曼公司;電泳儀 大連競(jìng)邁生物科技有限公司;倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司;熒光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將絨癌JEG-3細(xì)胞從-80 ℃冰箱取出,迅速放入37 ℃水中解凍,待全部融化后補(bǔ)加培養(yǎng)基并混勻,將細(xì)胞懸浮液以1500 r/min離心4 min,棄上清并重懸于含有10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)于37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%進(jìn)行傳代培養(yǎng)。吸出培養(yǎng)基,PBS洗滌細(xì)胞兩次并在37 ℃下用0.25%的胰蛋白酶消化,觀察到細(xì)胞微微皺縮立即加入培養(yǎng)基終止消化,反復(fù)吹打使細(xì)胞完全脫落。1500 r/min離心4 min,棄上清加入新培養(yǎng)基混勻放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2 d換液,3～4 d傳代。細(xì)胞傳代三次后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞相對(duì)活力測(cè)定 分別將α-亞麻酸和β-桐酸溶解在乙醇中,將JEG-3細(xì)胞(1×103cell/孔)接種在96孔板中培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基并分別加入不同濃度梯度的α-亞麻酸和β-桐酸,使其最終濃度達(dá)到20、40、60 μmol/L,以僅添加相同體積的溶劑乙醇組為空白組,以α-亞麻酸為陽性對(duì)照,培養(yǎng)24 h;此外,β-桐酸實(shí)驗(yàn)組更換培養(yǎng)基后分別加入β-桐酸使其終濃度為20、40、60 μmol/L,同時(shí)按前文設(shè)立空白組,分別培養(yǎng)24、36、48 h。培養(yǎng)結(jié)束后除去培養(yǎng)液,每孔加入MTT溶液(0.5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h。棄上清,每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO),室溫下振蕩10 min,在570 nm處測(cè)量吸光度。

細(xì)胞相對(duì)活力(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值×100/空白對(duì)照組OD值

1.2.3 通過LDH測(cè)定分析細(xì)胞的細(xì)胞毒性 將JEG-3細(xì)胞(1×103cell/孔)接種到96孔板中培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基,分別加入β-桐酸使終濃度達(dá)到20、40、60 μmol/L,同時(shí)按1.2.2設(shè)立空白組,在培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)24 h。吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清,按照說明書操作,配置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔、對(duì)照孔,混勻后室溫下放置5 min,待反應(yīng)結(jié)束后,在450 nm處測(cè)量吸光度值。當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí),細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞,細(xì)胞內(nèi)LDH釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中,乳酸在LDH作用下生成丙酮酸,丙酮酸和2,4-二硝基苯肼生成紅棕色的丙酮酸二硝基苯腙。通過檢測(cè)LDH活性,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞毒性的定量分析。

LDH活力(U/L)=(測(cè)定OD-對(duì)照OD)/(標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.2 mmol/L)×1000

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定凋亡率 將對(duì)數(shù)期的JEG-3細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基,分別加入β-桐酸使終濃度為20、40、60 μmol/L,同時(shí)按1.2.2設(shè)立空白組,培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,PBS洗滌兩次后將細(xì)胞以5×105cell/mL的濃度重懸于500 μL 的Annexin V結(jié)合緩沖液中,并添加5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶溶液(PI),充分混勻后,室溫下避光孵育10 min。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè),用Cell Quest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,每次計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞,計(jì)算并分析凋亡率。

凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)×100/總細(xì)胞數(shù)

1.2.5 蛋白免疫印跡分析 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于6孔(2×105cell/孔)細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基,分別加入β-桐酸使終濃度為20、40 μmol/L,同時(shí)按1.2.2設(shè)立空白組,培養(yǎng)細(xì)胞24 h。冰上提取細(xì)胞蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,室溫下封閉1 h。PBST與封閉液(5%脫脂奶粉)1∶1混合為一抗稀釋液,按1∶500比例分別稀釋?duì)?actin、Bcl-2以及Bax的抗鼠單克隆抗體和Caspase-3的抗兔多克隆抗體,與膜上蛋白在4 ℃過夜孵育。按照1∶5000的比例用PBST稀釋辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG,室溫孵育1 h。ECL顯影液顯色,凝膠成像儀拍照并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期的JEG-3細(xì)胞,調(diào)整濃度(1×104cell/mL)并接種2 mL于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基,分別加入β-桐酸使其終濃度為20、40 μmol/L,同時(shí)按1.2.2設(shè)立空白組,培養(yǎng)24 h后,除去細(xì)胞培養(yǎng)液與終濃度10 μmol/L的DCFH-DA在培養(yǎng)箱中共同孵育30 min。細(xì)胞用PBS洗兩次后,通過熒光顯微鏡,觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。此外,利用熒光分光光度計(jì),在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)525 nm下對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的DCF發(fā)射的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 NAC拮抗β-桐酸抑制JEG-3細(xì)胞活力 將JEG-3細(xì)胞(1×103cell/孔)接種在96孔板過夜培養(yǎng)至80%融合,更換培養(yǎng)基,分別加入β-桐酸使其終濃度為20、40 μmol/L,同時(shí)按1.2.2設(shè)立空白組、NAC組(僅添加5 mmol/L NAC)、β-桐酸+NAC組(20、40 μmol/Lβ-桐酸處理同時(shí)分別添加5 mmol/L NAC)培養(yǎng)24 h后測(cè)定吸光度。

細(xì)胞相對(duì)活力(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞相對(duì)活力的影響

應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同劑量的β-桐酸和α-亞麻酸(0～60 μmol/L)處理JEG-3細(xì)胞24 h后細(xì)胞相對(duì)活力的變化。結(jié)果如圖1a所示,與空白組相比,β-桐酸處理組細(xì)胞相對(duì)活力顯著降低(P<0.05),隨著作用濃度增加,β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞活力的抑制作用逐漸加強(qiáng)。不同劑量的β-桐酸(0～60 μmol/L)處理JEG-3細(xì)胞不同時(shí)間,細(xì)胞相對(duì)活力變化的結(jié)果見圖1b,隨著β-桐酸作用時(shí)間和濃度的增加,細(xì)胞相對(duì)活力顯著降低(P<0.05),β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞活力的抑制作用逐漸加強(qiáng),表明β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞活力的抑制作用呈明顯的時(shí)間和劑量依賴性。β-桐酸在濃度 20 μmol/L、處理時(shí)間24 h的條件下,即可顯著降低JEG-3細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞活力,更高的作用濃度和更長(zhǎng)的作用時(shí)間可使細(xì)胞的相對(duì)活力下降更為明顯(60 μmol/L,處理48 h細(xì)胞相對(duì)活力約為空白組的1/5),初步證實(shí)了植物來源的β-桐酸對(duì)人絨毛膜上皮癌JEG-3細(xì)胞活力的抑制作用。

圖1 β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of β-eleostearic acid on the cell vialility of JEG-3 cells注:a:β-桐酸和α-亞麻酸處理后JEG-3細(xì)胞的細(xì)胞相對(duì)活力比較,b:β-桐酸處理JEG-3細(xì)胞不同時(shí)間后的細(xì)胞相對(duì)活力變化;*表示與空白組相比差異顯著(P<0.05);圖2、圖4、圖7同。

2.2 β-桐酸促進(jìn)JEG-3細(xì)胞LDH的釋放

為了進(jìn)一步分析β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞的毒性作用,對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中LDH的酶活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示,與空白組相比,β-桐酸處理24 h后的JEG-3細(xì)胞,LDH活力顯著上升(P<0.05),β-桐酸的濃度由20 μmol/L增加到60 μmol/L時(shí),酶活力從191.8 U/L上升至283.3 U/L,說明β-桐酸促進(jìn)LDH的釋放,對(duì)JEG-3細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性。由于LDH釋放到培養(yǎng)液中說明細(xì)胞損傷導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性變化,因此,結(jié)果提示β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活力的抑制與細(xì)胞損傷有關(guān)。

圖2 β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞LDH釋放的影響Fig.2 Effect of β-eleostearic acid on LDH release of JEG-3 cells

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染法,并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞凋亡的影響。Annexin V-FITC染色呈陽性且PI染色呈陰性,即右下象限為凋亡早期細(xì)胞,Annexin V-FITC染色和PI染色呈雙陽性,即右上象限為凋亡晚期細(xì)胞。如圖3所示,β-桐酸處理JEG-3細(xì)胞24 h后,隨著β-桐酸濃度的增加,凋亡的JEG-3細(xì)胞明顯增多。對(duì)凋亡率做出統(tǒng)計(jì)得到圖4,結(jié)果表明隨著β-桐酸濃度的增加,JEG-3細(xì)胞的凋亡率隨之顯著增加(P<0.05)。當(dāng)β-桐酸的濃度為20 μmol/L時(shí),凋亡率為34.4%,與空白組相比具有顯著性差異;濃度為40 μmol/L時(shí),細(xì)胞凋亡率達(dá)到55.4%,濃度達(dá)到60 μmol/L時(shí),凋亡率則高達(dá)73.93%,提示β-桐酸能夠誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡。結(jié)合β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞相對(duì)活力及LDH釋放的影響,推測(cè)β-桐酸可能通過對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用,引起細(xì)胞損傷。

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)JEG-3細(xì)胞凋亡Fig.3 JEG-3 cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining method注:A:control組;B:20 μmol/L β-桐酸組;C:40 μmol/L β-桐酸組;D:60 μmol/L β-桐酸組。

圖4 β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞凋亡率的影響Fig.4 The effect of β-eleostearic acid on the apoptosis rate of JEG-3 cells

2.4 蛋白免疫印跡檢測(cè)β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步分析β-桐酸誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,采用蛋白免疫印跡法,檢測(cè)β-桐酸處理JEG-3細(xì)胞后,凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3、Bax、Bcl-2)在細(xì)胞中的表達(dá)。由于高濃度和長(zhǎng)時(shí)間處理有可能導(dǎo)致更多的體外培養(yǎng)細(xì)胞在誘導(dǎo)凋亡后出現(xiàn)細(xì)胞死亡、碎裂,干擾相關(guān)機(jī)制的研究[27-29],而低、中濃度β-桐酸(20和40 μmol/L)處理JEG-3細(xì)胞24 h后,細(xì)胞凋亡率與空白組相比即具有顯著性差異,因此選擇此條件進(jìn)行以下相關(guān)機(jī)制的研究。結(jié)果如圖5所示,經(jīng)過20和40 μmol/Lβ-桐酸處理后,JEG-3細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)水平與空白組相比明顯上調(diào),同時(shí),促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-2的比值(Bax/Bcl-2)也隨之增加。證實(shí)β-桐酸能夠促進(jìn)JEG-3細(xì)胞的凋亡過程。在細(xì)胞凋亡的內(nèi)源途徑中,線粒體膜通透性的改變主要受到Bcl-2蛋白家族的調(diào)控。β-桐酸處理后JEG-3細(xì)胞Bax/Bcl-2比值的增加提示β-桐酸誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡的作用可能與其通過內(nèi)源途徑影響線粒體膜通道的開啟有關(guān)。

圖5 β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2表達(dá)的影響Fig.5 Effects of β-eleostearic acid on the expression of Caspase-3,Bax and Bcl-2 of JEG-3 cells

2.5 β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

應(yīng)用活性氧標(biāo)記熒光染料H2DCFDA,利用熒光顯微鏡和熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,分析β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響。圖6結(jié)果顯示,與空白組相比,β-桐酸處理組JEG-3細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增強(qiáng)。熒光分光光度分析結(jié)果如圖7所示,經(jīng)β-桐酸處理后的JEG-3細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯上升,證實(shí)β-桐酸可以誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞產(chǎn)生ROS,提示ROS的產(chǎn)生可能與β-桐酸對(duì)JEG-3的誘導(dǎo)凋亡作用有關(guān)。

圖6 熒光顯微鏡觀察β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞的ROS水平的影響Fig.6 Effect of β-eleostearic acid on ROS level in JEG-3 cells by fluorescence microscopy注:A:control組;B:20 μmol/L β-桐酸組;C:40 μmol/L β-桐酸組。

圖7 熒光分光光度法檢測(cè)β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.7 Effect of β-eleostearic acid on ROS level of JEG-3 cells by fluorescence spectrophotometry

2.6 NAC拮抗β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞活力的抑制作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ROS在β-桐酸抑制JEG-3細(xì)胞活力中的作用,聯(lián)合應(yīng)用ROS抑制劑NAC和MTT實(shí)驗(yàn),分析ROS在β-桐酸抑制JEG-3細(xì)胞活力過程中的作用。結(jié)果如圖8所示,20和40 μmol/Lβ-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞進(jìn)行處理后,細(xì)胞相對(duì)活力顯著下降(P<0.05)。單獨(dú)NAC作用后,與空白組相比細(xì)胞相對(duì)活力沒有顯著差異。但是,與β-桐酸相比，在β-桐酸和NAC共同作用下,細(xì)胞相對(duì)活力顯著上升,提示β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞活力抑制作用可能與ROS的產(chǎn)生有關(guān)。有研究表明,β-桐酸能夠通過影響ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡[27]。α-金盞花酸和β-金盞花酸(植物來源的兩種共軛亞麻酸異構(gòu)體)影響JEG-3細(xì)胞凋亡的作用也與ROS的產(chǎn)生有關(guān)[28]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,進(jìn)一步提示了植物來源共軛亞麻酸通過調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

圖8 NAC拮抗β-桐酸誘導(dǎo)的JEG-3細(xì)胞活力抑制作用Fig.8 NAC antagonizes the cell vialility inhibition of JEG-3 cells induced by β-eleostearic acid注:*表示與空白組相比有顯著差異(P<0.05);#表示與β-桐酸組比較有顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

本文研究發(fā)現(xiàn),β-桐酸對(duì)體外培養(yǎng)的人絨毛膜上皮癌JEG-3細(xì)胞的活力有明顯的抑制作用,且呈現(xiàn)明顯的劑量、時(shí)間依賴性。β-桐酸能夠明顯促進(jìn)JEG-3細(xì)胞LDH的釋放,對(duì)細(xì)胞有明顯的毒性作用,進(jìn)一步證實(shí)β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞的損傷。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示β桐酸顯著促進(jìn)JEG-3細(xì)胞凋亡,蛋白免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn),β桐酸能夠上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)水平,增加Bax/Bcl-2的表達(dá)比例,證實(shí)β-桐酸具有誘導(dǎo)JEG-3細(xì)胞凋亡的作用。β-桐酸可以促進(jìn)JEG-3細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,ROS抑制劑NAC拮抗β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞活力的抑制作用,提示β-桐酸對(duì)人絨毛膜上皮癌JEG-3細(xì)胞的影響可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為人絨毛膜上皮癌的輔助治療研究及拓展β-桐酸的應(yīng)用范圍奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是,本研究?jī)H對(duì)β-桐酸抑制JEG-3細(xì)胞及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討,其相關(guān)的分子機(jī)制仍有待在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入的研究。此外,雖然本研究在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證明了β-桐酸對(duì)JEG-3細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,但β-桐酸在體內(nèi)環(huán)境下對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞的作用仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型來證實(shí)。