劉 政,王 會(huì)(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001)

肝癌是發(fā)生在肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞的惡性腫瘤,具有治愈難、預(yù)后差等特征,其治療是臨床亟待解決的問題。尋找安全有效、靶點(diǎn)明確、低毒的天然抗腫瘤藥物是科學(xué)界研究的焦點(diǎn),從中草藥中篩選有效的活性物質(zhì)治療肝癌是中藥發(fā)展的重要渠道。

高良姜素是天然的黃酮醇類化合物(3,5,7-三羥基黃酮,圖1),可從植物高良姜植株的地上部分[1]及根莖[2-3]和蜂膠[4]中提取得到。研究發(fā)現(xiàn),高良姜素具有鎮(zhèn)痛、止嘔、抗氧化作用[5]及抗腫瘤作用[6-7]。高良姜素可抑制皮膚癌[8]、人骨瘤MG-63[9]、肝癌BEL-7402[10]腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡[11]。本實(shí)驗(yàn)檢測高良姜素對肝癌細(xì)胞HepG-2的細(xì)胞毒性,應(yīng)用形態(tài)學(xué)分析、凋亡率檢測進(jìn)行凋亡作用測定,并初步探討高良姜素對細(xì)胞周期、線粒體膜電位及胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響。本文研究高良姜素對肝癌細(xì)胞HepG-2增殖及凋亡作用,為高良姜的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 高良姜素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of galangin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高良姜素(純度≥98.0%)、喜樹堿(純度≥98.0%) 成都曼斯特生物科技有限公司;人肝癌HepG-2 細(xì)胞 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所遺傳資源實(shí)驗(yàn)室提供;胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基 美國GIBCO公司;碘化丙啶(propidium iodide,PI) 美國Sigma公司;Annexin V-FITC Apoptosis Detection試劑盒、JC-1探針 美國BD公司;Fluo-3/AM 美國Invitrogen公司。

BB15 CO2培養(yǎng)箱 德國Heraeus公司;IX-71倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司;FC-500流式細(xì)胞儀 美國Beckman公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG-2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)基中,培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2、飽和濕度。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合度時(shí)用0.25%胰酶消化細(xì)胞并傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物配制 高良姜素和喜樹堿先用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,然后再溶于培養(yǎng)基(DMSO終濃度小于0.05%)。配制培養(yǎng)基分別含有高良姜素濃度為2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL;含有喜樹堿濃度為6.96、13.92和27.84 μg/mL,備用。

1.2.3 細(xì)胞毒性分析 取180 μL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板,細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)分別換用含有2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素的培養(yǎng)基培養(yǎng),設(shè)置空白對照組(用含DMSO的培養(yǎng)基處理,DMSO終濃度為0.05%)和陽性對照組(以喜樹堿為陽性對照,6.96、13.92和27.84 μg/mL)[12-13],每組設(shè)5個(gè)重復(fù),作用時(shí)間分別為12、24、36、48 h,然后每孔加入3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)20 μL(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)基。每孔加入200 μL DMSO,充分振蕩,酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測吸光度OD值。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析 細(xì)胞接種于六孔板(3.0×105cell/孔),待24 h后細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期[14],分別用2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素處理細(xì)胞24 h,并設(shè)空白對照組(用含DMSO的培養(yǎng)基處理,DMSO終濃度為0.5%)和陽性對照組(以喜樹堿為陽性對照,27.84 μg/mL)。應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞接種24 h進(jìn)入對數(shù)生長期,收集經(jīng)2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素和27.84 μg/mL喜樹堿(陽性對照)處理12、24、36、48 h的各組細(xì)胞及空白對照組(用含DMSO的培養(yǎng)基處理,DMSO終濃度為0.5%)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×105cell/樣品,每個(gè)樣品分別加入100 μL緩沖液和5 μL AnnexinV-FITC及5 μL PI?；靹?避光孵育10 min,流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 細(xì)胞周期檢測 細(xì)胞接種24 h進(jìn)入對數(shù)生長期,經(jīng)高良姜素處理24 h,收集經(jīng)2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素處理的細(xì)胞和空白對照組(用含DMSO的培養(yǎng)基處理,DMSO終濃度為0.05%)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×105cell/樣品,細(xì)胞于70%無水乙醇,4 ℃處理12 h。PBS洗滌2次,加入0.5 mL PI染液,4 ℃ 避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 線粒體膜電位檢測 細(xì)胞接種24 h進(jìn)入對數(shù)生長期,經(jīng)高良姜素處理24 h,收集經(jīng)2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素處理的各組細(xì)胞和空白對照組(用含DMSO的培養(yǎng)基處理,DMSO終濃度為0.5%)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106cell/樣品,加入0.5 mL JC-1染色液,于培養(yǎng)箱避光孵育20 min,用37 ℃預(yù)熱的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌,0.5 mL PBS 懸浮,流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測定 細(xì)胞接種24 h進(jìn)入對數(shù)生長期,收集經(jīng)2.7、5.4、10.8和21.6 μg/mL高良姜素處理24 h的各組細(xì)胞和空白對照組(用含DMSO的培養(yǎng)基處理,DMSO終濃度為0.5%)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106cell/mL。加入Fluo-3/Am(終濃度為8 μmol/L),于培養(yǎng)箱避光孵育30 min,期間振蕩4次,設(shè)置陰性對照(不加Fluo-3/Am)。用無鈣離子PBS漂洗2次,PBS重懸至0.5 mL,流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞毒性分析

MTT法細(xì)胞毒性分析是檢測細(xì)胞存活和增殖活性的最常規(guī)、最經(jīng)典的方法。不同濃度高良姜素分別作用HepG-2細(xì)胞12、24、36、48 h,OD490值反映的是活細(xì)胞數(shù)量,OD490值減小,顯示活細(xì)胞數(shù)量減少。高良姜素處理細(xì)胞12 h時(shí),21.6 μg/mL高良姜素處理組OD490值與空白對照組比較減小,差異顯著(P<0.05)。其中,5.4 μg/mL濃度組OD490值大于2.7 μg/mL濃度組OD490值,但兩組相比較差異不顯著,推測出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是兩個(gè)濃度的高良姜素作用細(xì)胞12 h未對細(xì)胞產(chǎn)生差異的毒性作用。高良姜素處理細(xì)胞24 h時(shí),10.8 μg/mL高良姜素處理組OD490值與空白對照組比較減小,差異顯著(P<0.05);21.6 μg/mL高良姜素處理組OD490值與空白對照組比較減小,差異極顯著(P<0.01)。高良姜素處理細(xì)胞36 h時(shí),5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組OD490值分別與空白對照組比較均減小,差異極顯著(P<0.01)。高良姜素處理細(xì)胞48 h時(shí),5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組OD490值分別與空白對照組比較均減小,差異極顯著(P<0.01)(表1)。在同一作用時(shí)間,隨著高良姜素濃度的增大其OD490值逐漸減小,顯示活細(xì)胞數(shù)量減少,呈現(xiàn)量效關(guān)系。陽性對照喜樹堿處理的各組細(xì)胞OD490值隨其濃度增大也減小,高良姜素處理組與陽性對照組比較,表現(xiàn)出良好的細(xì)胞毒性作用,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與高良姜素對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的作用結(jié)果一致[12],為后續(xù)的凋亡作用研究提供基礎(chǔ)。

表1 高良姜素對HepG-2細(xì)胞生長的影響(n=3)Table 1 Effect of galangin on growth of HepG-2(n=3)

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

對照組細(xì)胞飽滿、立體感好,排列緊密,邊緣清晰,細(xì)胞折光度好。高良姜素處理24 h后,2.7 μg/mL處理組細(xì)胞未出現(xiàn)明顯變化;5.4 μg/mL處理組細(xì)胞出現(xiàn)空泡,胞體縮小;10.8 μg/mL處理組細(xì)胞形態(tài)變得模糊不清,空泡及細(xì)胞碎片增多;21.6 μg/mL處理組細(xì)胞間連接幾乎消失,胞體縮小,細(xì)胞膜皺縮,細(xì)胞膜表面凹凸不平,細(xì)胞裂解成較小的碎片,出現(xiàn)細(xì)胞壞死。喜樹堿27.84 μg/mL處理組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象和高良姜素21.6 μg/mL處理組相似(圖2)。隨著高良姜素處理濃度的增大細(xì)胞發(fā)生凋亡作用的形態(tài)表現(xiàn)愈加嚴(yán)重。

圖2 高良姜素處理HepG-2細(xì)胞24 h細(xì)胞形態(tài)(40×)Fig.2 Cell morphology of HepG-2 treated with galangin at 24 h(40×)

2.3 細(xì)胞凋亡率的測定

雙標(biāo)記法能夠定量分析細(xì)胞凋亡,并可定量分析凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。檢測結(jié)果顯示,高良姜素處理細(xì)胞12 h時(shí),10.8 μg/mL高良姜素處理組凋亡率與空白對照組比較增高,差異顯著(P<0.05),21.6 μg/mL高良姜素處理組凋亡率與空白對照組比較增高,差異極顯著(P<0.01)。高良姜素處理細(xì)胞24 h時(shí),5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組凋亡率分別與空白對照組比較增高,差異極顯著(P<0.01)。高良姜素處理細(xì)胞36 h時(shí),5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組凋亡率分別與空白對照組比較增高,差異極顯著(P<0.01)。高良姜素處理細(xì)胞48 h時(shí),5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組凋亡率分別與空白對照組比較增高,差異極顯著(P<0.01)。隨著高良姜素作用濃度的增大,凋亡率逐漸增大,且呈現(xiàn)濃度依賴性。各處理時(shí)間的陽性對照喜樹堿27.84 μg/mL處理組凋亡率高于高良姜素21.6 μg/mL處理組(表2)。

表2 高良姜素處理HepG-2細(xì)胞凋亡率(%)(n=3)Table 2 The apoptosis rate of HepG-2 treated with galangin(%)(n=3)

2.4 細(xì)胞周期檢測

細(xì)胞周期是個(gè)連續(xù)的動(dòng)態(tài)過程,如某環(huán)節(jié)受到干擾,必將影響細(xì)胞增殖進(jìn)而影響整個(gè)生命活動(dòng)。細(xì)胞周期的不同時(shí)相必須高度精確有條不紊的進(jìn)行,細(xì)胞必須在完成上一次時(shí)相后才能進(jìn)入下一個(gè)時(shí)相。將細(xì)胞周期的理論應(yīng)用于藥物研究,其作用機(jī)制為時(shí)相特異性,將細(xì)胞阻止在特定的時(shí)相。高良姜素誘導(dǎo)肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果表明,高良姜素阻斷細(xì)胞于G1期,且呈現(xiàn)劑量依賴性[15]。本文檢測結(jié)果顯示,高良姜素處理細(xì)胞24 h時(shí),5.4 μg/mL高良姜素處理組,處于G1期細(xì)胞的數(shù)量增多,與空白對照組比較差異顯著(P<0.05);10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組,處于G1期細(xì)胞的數(shù)量增多,與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01);10.8、21.6 μg/mL高良姜素處組,處于S期細(xì)胞的數(shù)量增多,與空白對照組比較差異極顯著(P<0.01);21.6 μg/mL高良姜素處理組,處于G2期細(xì)胞的數(shù)量減少,與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)。隨著高良姜素濃度的增大,處在G1期細(xì)胞數(shù)增多,S期細(xì)胞數(shù)下降,G2期細(xì)胞數(shù)下降,表明細(xì)胞經(jīng)高良姜素處理后增殖停滯在G1期,DNA合成受阻,這種關(guān)系隨著高良姜素劑量的增大而愈加明顯,呈現(xiàn)劑量依賴性(表3)。

表3 高良姜素處理HepG-2細(xì)胞24 h,細(xì)胞周期的變化(n=3)Table 3 Changes in the cell cycle of HepG-2 treated with galangin for 24 h(n=3)

2.5 線粒體膜電位檢測

隨著對細(xì)胞凋亡機(jī)制不斷研究,細(xì)胞器線粒體得到了前所未有的關(guān)注。線粒體在細(xì)胞凋亡的過程中起著調(diào)控器的作用。線粒體跨膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件,它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征出現(xiàn)之前,一旦線粒體跨膜電位崩潰,則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。研究顯示,高良姜素誘導(dǎo)肝癌BEL-7402細(xì)胞線粒體膜電位下降[15]。本文檢測結(jié)果顯示,高良姜素處理細(xì)胞24 h時(shí),5.4、10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組線粒體膜電位下降,與空白對照比較差異極顯著(P<0.01)(表4)。隨著高良姜素處理濃度的增大線粒體膜電位越低,呈現(xiàn)劑量依賴性,表明細(xì)胞發(fā)生凋亡作用程度越嚴(yán)重。

表4 高良姜素處理HepG-2細(xì)胞24 h,線粒體膜電位變化(n=3)Table 4 Mitochondrial membrane potential changes of HepG-2 treated with galangin for 24 h(n=3)

2.6 細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子測定

鈣離子作為第二信使在細(xì)胞乃至整個(gè)有機(jī)體生命活動(dòng)中起著重要的調(diào)控作用。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化直接影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等生命現(xiàn)象,因此,鈣作為第二信使在細(xì)胞凋亡中的作用一直是細(xì)胞生物學(xué)研究的重點(diǎn)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子的增多和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子的排空均可激活凋亡啟動(dòng)因子。目前認(rèn)為鈣離子信號可能是通過細(xì)胞或線粒體鈣超載和鈣依賴酶激活這兩種方式來控制凋亡的。檢測結(jié)果顯示,高良姜素作用細(xì)胞24 h時(shí),5.4 μg/mL高良姜素處理組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度增高,與空白對照比較差異顯著(P<0.05);10.8、21.6 μg/mL高良姜素處理組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度增高,與空白對照比較差異極顯著(P<0.01)(表5)。隨高良姜素濃度增大,細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度逐漸增高,呈現(xiàn)劑量依賴性,表明細(xì)胞發(fā)生凋亡作用程度越嚴(yán)重。

表5 高良姜素處理HepG-2細(xì)胞24 h,胞內(nèi)Ca2+濃度的變化(n=3)Table 5 Intracellular Ca2+ concentration changes of HepG-2 treated with galangin for 24 h(n=3)

3 討論與結(jié)論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是復(fù)雜的基因調(diào)控失調(diào)所致,是細(xì)胞增殖和凋亡平衡被打亂的結(jié)果。隨著人們對凋亡機(jī)理的研究,發(fā)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的有效途徑之一。

細(xì)胞毒性結(jié)果表明,高良姜素可以抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞生長,并呈現(xiàn)時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系,這與先前的研究結(jié)果相似,高良姜素可體外抑制多種癌細(xì)胞增殖,如乳腺癌[16]、肺癌[17]、口腔癌[18]和白血病細(xì)胞[19]。細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析及凋亡率檢測結(jié)果和細(xì)胞毒性結(jié)果一致。

腫瘤是一種細(xì)胞周期失控性疾病,細(xì)胞無限增殖,導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,最終形成腫瘤[20],對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測是研究細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)之一,通過干擾細(xì)胞周期進(jìn)程來誘導(dǎo)凋亡也作為抗腫瘤研究的一個(gè)新思路[21]。檢測高良姜素對HepG-2細(xì)胞周期的影響,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯,導(dǎo)致進(jìn)入G2期細(xì)胞數(shù)量減少,造成進(jìn)入M期的細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞分裂受阻,細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與先前研究結(jié)果存在差異,有報(bào)道顯示,高良姜素導(dǎo)致肝癌HepG-2[22]、肺癌A549細(xì)胞[23]和胃癌SGC-7901細(xì)胞[24]發(fā)生G2/M期細(xì)胞周期停滯,從而抑制其增殖。推測高良姜素通過干擾細(xì)胞周期時(shí)相的分布從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這為以后開展高良姜素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)理的研究提供了重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

線粒體與細(xì)胞凋亡過程中許多重要事件相關(guān),并在其中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[25],線粒體膜電位下降,膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放,線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子外流進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),從而激活Caspase凋亡途徑啟動(dòng)凋亡程序[26]。研究表明,高良姜素可使人肝癌細(xì)胞線粒體膜電位降低,從而促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27-28]。本實(shí)驗(yàn)采用JC-1探針標(biāo)記應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位變化,發(fā)現(xiàn)經(jīng)高良姜素處理后的HepG-2細(xì)胞線粒體膜電位降低,并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。推測高良姜素誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡與細(xì)胞凋亡線粒體途徑有關(guān)。

在正常生理狀態(tài)下,細(xì)胞中Ca2+主要與蛋白質(zhì)結(jié)合形成結(jié)合態(tài)封存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,游離的Ca2+很少,當(dāng)收到外界刺激時(shí)結(jié)合態(tài)變?yōu)橛坞x態(tài)充當(dāng)信號分子。游離Ca2+在細(xì)胞內(nèi)的過度累積可以致使細(xì)胞凋亡的發(fā)生[29-30]。當(dāng)高良姜素處理HepG-2細(xì)胞時(shí),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+濃度升高且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系,Ca2+穩(wěn)態(tài)被打破,適當(dāng)濃度的高良姜素可誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)合線粒體膜電位下降的結(jié)果,推測與線粒體內(nèi)鈣離子的釋放有關(guān),但其具體機(jī)理還需進(jìn)一步的研究。

綜上所述,高良姜素可阻滯細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能是通過干擾細(xì)胞周期進(jìn)程及鈣離子穩(wěn)態(tài)和降低線粒體膜電位來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。