吳 婷,趙澤安,陳演瑜,李詠梅,徐赫笛,高 尚,龐建新(南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州 510515)

高尿酸血癥與高血壓、高血糖、高血脂共稱為“四高”代謝性疾病,以人體血清尿酸水平異常升高為特征[1]。高尿酸血癥與尿酸生成和(或)尿酸排泄減少有關(guān)[2-3],可引起痛風(fēng)、高血壓、心血管疾病及腎臟病變等[4]。

體內(nèi)尿酸主要經(jīng)腎臟排出,依賴于多種表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的協(xié)同作用[5-6],包括尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(urate transporter 1,URAT1)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1～4(organic anion transporter 1～4,OAT1～4)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體10(organic anion transporter 10,OAT10)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體9(glucose transporter 9,GLUT9)和腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2(ATP binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)等。其中,主要以尿酸為底物的轉(zhuǎn)運(yùn)體是URAT1和GLUT9,對腎臟尿酸排泄過程起重要調(diào)節(jié)作用[7-8]。腎小球?yàn)V過的尿酸90%由URAT1和GLUT9在近曲小管重吸收,10%由其它轉(zhuǎn)運(yùn)體在遠(yuǎn)端吸收和分泌,如OAT1與ABCG2。URAT1分布在腎小管上皮細(xì)胞頂質(zhì)膜上,負(fù)責(zé)將腎小管腔內(nèi)的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞內(nèi),再由基質(zhì)膜側(cè)的GLUT9轉(zhuǎn)運(yùn)入血。

與多種多樣可供選擇的降壓、降糖、降脂藥物不同的是,目前臨床使用的降尿酸藥物種類極少,且主要以促尿酸從腎臟排泄,或抑制XOD活性的藥物為主。國內(nèi)最常用的促尿酸排泄藥物為苯溴馬隆,其通過抑制尿酸在腎小管的重吸收,促進(jìn)尿酸從腎臟排泄從而發(fā)揮降尿酸作用。但因選擇性低,毒副作用大,尤其是可引起爆發(fā)性肝炎[9],FDA一直沒批準(zhǔn)該藥在美國上市,歐洲也曾經(jīng)一度叫停[10]。另一臨床常用的抑制XOD活性的降尿酸藥物為別嘌呤醇(allopurinol,AP),其通過抑制尿酸生成發(fā)揮降尿酸作用。但長期服用別嘌呤醇會導(dǎo)致肝腎損害、過敏、骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等[11-12],且服用該藥的的患者只有不到40%可將血清尿酸濃度降低至目標(biāo)水平,因此在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。飲食干預(yù)在防治多種慢性疾病(如癌癥、糖尿病、高尿酸血癥)中受到了越來越多的關(guān)注[13-15]。許多研究人員也試圖從天然產(chǎn)物或食品中尋找防治高尿酸血癥的方法[16]。

大麥(Hordeumvulgare),屬大麥屬(Hordeum)早熟禾科(Poaceae)一年生草本植物[17]。其嫩苗富含類黃酮、維生素、抗氧化酶及蛋白質(zhì)等多種功能營養(yǎng)成分,在日本與中國被廣泛用于制備大麥葉粉(BLP)作為一種健康飲品。國外研究表明,大麥具有抗糖尿病、抗炎、抗氧化、抗抑郁等作用,是防治人類慢性病最佳的功能性食品[18]。Hokazono等[19]的研究已表明,發(fā)酵的大麥提取物可降低高尿酸患者血清尿酸,但該研究并未闡明其作用機(jī)制,且未報道BLP對高尿酸誘發(fā)的腎臟損傷的保護(hù)作用。本文將系統(tǒng)評價大麥葉粉(Barley leaf powder,BLP)對氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠體內(nèi)尿酸水平的影響及其腎臟保護(hù)作用,為大麥葉粉在食品中的實(shí)際應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級昆明種雄性小鼠(體重18±2 g) 購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,在(23±2) ℃,相對濕度50%～80%(每天12 h日光燈照射)條件下飼養(yǎng),通過南方醫(yī)科大學(xué)倫理委員會同意(批準(zhǔn)號:No.44002100008061);BLP 鄭州真好集團(tuán);別嘌呤醇(allopurinol,AP) 美國Sigma公司;尿酸(uric acid,UA)、肌酐(creatinine,CR)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)測定試劑盒 美國BioAssay Systems;氧嗪酸鉀(potassium oxazinate,PO)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;RNA提取試劑盒 中國Foregene;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 日本Takara;引物合成 生工生物工程(上海)股份有限公司。

Mill-iQ型純水系統(tǒng) 美國Millipore;Sigma 3K30高速低溫離心機(jī) 德國Sigma;Infinite M200型酶標(biāo)儀 瑞士TECAN;7500型實(shí)時熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems ABI。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備 小鼠高尿酸血癥模型制備參考文獻(xiàn)中的方法[20-22],并做適當(dāng)改動。300 mg/kg氧嗪酸鉀混懸液的配制:稱取適量PO溶于0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose,CMC-Na)中,超聲30 min使其充分混懸。連續(xù)腹腔注射14 d,正常組則腹腔注射等體積溶媒。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 48只雄性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對照組、模型組、別嘌呤醇組(陽性對照組,10 mg/kg)、BLP低中高三個劑量組(50、100、200 mg/kg),每組8只動物。Takano等[23]表明1500 mg/kg BLP對大鼠是安全的,因此,本文初步探索了150 mg/kg BLP的降尿酸效果,發(fā)現(xiàn)其降尿酸作用十分明顯,因此后續(xù)在此基礎(chǔ)上設(shè)置了上述三個劑量組。此外,BLP作為一種已上市產(chǎn)品,安全性高,其在人體中的推薦每日使用劑量約為43 mg/kg,換算成小鼠則為391 mg/kg,可見本實(shí)驗(yàn)采用劑量是安全的。造模前,給BLP各組小鼠分別灌胃不同劑量BLP(溶于0.9%生理鹽水),持續(xù)7 d。第8 d開始,除正常組腹腔注射生理鹽水外,其余組均腹腔注射PO溶液。除正常對照組外,其余各組動物在造模后1 h分別灌胃給以相應(yīng)藥物,造模與給藥共持續(xù)14 d(整個實(shí)驗(yàn)共持續(xù)21 d)。第20 d給藥后,將各組小鼠置于代謝籠中收集24 h尿液與糞便樣品。第21 d末次給藥后1 h,取血并處死小鼠,3000 r/min離心15 min分離血清?？焖儆诒先「闻K與腎臟組織,分別保存于-80 ℃用于檢測目的基因mRNA相對表達(dá)水平或用4%多聚甲醛固定。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 The experimental design of this study

1.2.3 指標(biāo)分析 用試劑盒測定血清UA、CR、BUN水平、尿液UA、糞便UA水平、血清與肝臟中XOD活性。

1.2.4 腎臟與肝臟病理學(xué)觀察 將1.2.2中固定于4%多聚甲醛溶液中的組織樣品用石蠟包埋,制作病理切片,進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE),用顯微鏡觀察組織切片的變化情況。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR) 利用RNA提取試劑盒提取腎皮質(zhì)中RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,具體程序參考文獻(xiàn)[16]。引物序列見下表1(引物序列參考網(wǎng)址https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)。利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量(內(nèi)參基因?yàn)棣?Actin)。

表1 引物序列 Table 1 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 BLP對高尿酸血癥小鼠血清、尿液、糞便UA、血清CR與BUN水平的影響

由表2可知,同空白組比較,造模14 d后模型組小鼠血清UA高度顯著增加(P<0.001),表明高尿酸血癥模型造模成功;與模型組相比,BLP各劑量組均能高度顯著降低其血清UA水平(P<0.001)。模型組的24 h尿液UA極顯著低于空白組(P<0.01),糞便UA水平顯著低于空白組(P<0.05),而200 mg/kg BLP分別高度顯著增加尿液UA(P<0.001),極顯著增加腸道排泄量(P<0.01)。體內(nèi)次黃嘌呤和黃嘌呤在XOD的催化下生成UA,陽性藥AP為XOD抑制劑,可通過抑制XOD活性而減少體內(nèi)UA的生成[24]。表2結(jié)果顯示,與模型組相比,AP對UA排泄的影響不顯著(P>0.05)。

表2 BLP對高尿酸血癥小鼠血清、尿液、糞便UA、血清CR與BUN水平的影響Table 2 Effects of BLP on serum,urinary,fecal UA,serum CR and BUN levels in PO-induced hyperuricemic mice

血清CR與BUN是臨床評估腎臟損傷的常用指標(biāo)。腎臟受損會伴隨兩者水平升高[25]。如表2所示,同空白組相比,造模14 d后模型組血清CR水平顯著升高(P<0.05),BUN水平高度顯著升高(P<0.001),表明持續(xù)的高尿酸可一定程度引起腎臟損傷。陽性對照組AP并未使CR與BUN降低,反而一定程度升高兩者水平,提示AP長期用藥可能對腎臟產(chǎn)生損傷,與文獻(xiàn)報道相符[26-27]。相反,BLP給藥3周能極顯著降低血清CR水平(P<0.01),高度顯著降低BUN水平(P<0.001),表明BLP在保護(hù)腎功能方面具有一定作用。

2.2 BLP對高尿酸血癥小鼠血清與肝臟XOD活性、肝臟UA的影響

XOD主要位于肝臟,是一種催化次黃嘌呤生成尿酸的關(guān)鍵酶。該酶主要存在于哺乳動物的肝臟中,正常人血清中不能檢出或含量甚微。當(dāng)肝臟內(nèi)尿酸水平明顯增高時,XOD釋放入血清[28],因此,本文通過同時檢測血清與肝臟XOD活性,并結(jié)合肝臟UA水平評價BLP對尿酸生成的影響,旨在闡明其降尿酸的機(jī)制之一。由表3可知,BLP各劑量組與陽性藥AP能高度顯著降低高尿酸血癥小鼠血清與肝臟XOD活性(P<0.001),200 mg/kg BLP同時高度顯著減少肝臟UA的生成(P<0.001)。

表3 BLP對高尿酸血癥小鼠血清與肝臟XOD活性、肝臟UA水平的影響Table 3 Effects of BLP on serum and hepatic XOD activities,hepatic UA levels in PO-induced hyperuricemic mice

2.3 BLP對高尿酸血癥小鼠腎臟組織病理學(xué)的影響

圖2顯示,模型組腎臟炎癥浸潤明顯,而BLP能明顯改善上述癥狀,200 mg/kg劑量組最為明顯。與表2中血清CR和BUN水平結(jié)果一致,AP組并不能降低高尿酸導(dǎo)致的腎臟損傷,反而升高血清CR與BUN水平,加重腎臟損傷。如圖2F所示,AP顯著加劇腎小管擴(kuò)張。

圖2 BLP對氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠腎臟的影響(×400)Fig.2 Effects of BLP on the pathological changes of kidney in hyperuricemia mice induced by PO(×400).注:A:空白組;B:模型組;C:BLP 50 mg/kg;D:BLP 100 mg/kg;E:BLP 200 mg/kg;F:AP 10 mg/kg;○表示炎性浸潤;表示腎小管擴(kuò)張。

2.4 BLP對高尿酸血癥小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平的影響

由圖3可見,模型組小鼠腎皮質(zhì)URAT1與GLUT9 mRNA水平高度顯著增加(P<0.001),OAT1與ABCG2表達(dá)高度顯著減少(P<0.001)。200 mg/kg BLP能高度顯著下調(diào)URAT1與GLUT9的mRNA表達(dá)水平(P<0.001),高度顯著上調(diào)OAT1 mRNA表達(dá)水平(P<0.001),對ABCG2的表達(dá)無顯著影響(P>0.05),提示其可能通過抑制URAT1與GLUT9從而減少UA的重吸收,同時上調(diào)OAT1功能從而增加尿液UA排出量,繼而使血清UA水平明顯降低。

圖3 BLP對高尿酸血癥小鼠腎皮質(zhì)URAT1、GLUT9、OAT1與ABCG2 mRNA表達(dá)水平的影響(n=4)Fig.3 Effects of BLP on the mRNA expressions of URAT1,GLUT9,OAT1 and ABCG2 in the kidney cortex tissues(n=4)注:###P<0.001表示與空白組相比;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001表示與模型組相比;n.s.表示與模型組相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論與結(jié)論

HUA是體內(nèi)嘌呤類物質(zhì)代謝紊亂所導(dǎo)致的疾病,越來越多研究者從天然食品中發(fā)現(xiàn)可用于防治HUA的潛在藥物,如檸檬水[16]、姜黃素[20]等。本研究發(fā)現(xiàn)了純天然健康食品BLP的體內(nèi)降尿酸活性,可通過抑制XOD活性降低UA的產(chǎn)生,通過下調(diào)腎臟URAT1和GLUT9的表達(dá),增加UA的腎臟排泄,從而顯著降低血清UA。

人體內(nèi)UA主要經(jīng)腎臟排泄(2/3),同時可經(jīng)腸道排泄(1/3)。腎臟中的多種尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體共同調(diào)控著體內(nèi)尿酸穩(wěn)態(tài)。其中位于腎近端小管細(xì)胞頂端和基底外側(cè)膜上的URAT1和GLUT9是將UA從腎小管腔重吸收到血液的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,而OAT1和ABCG2則是分別位于基底外側(cè)膜和頂端,負(fù)責(zé)將尿酸從血液中轉(zhuǎn)運(yùn)到腎小管腔中,促進(jìn)尿酸的分泌[7-8]。從圖3可以看出,BLP顯著降低了URAT1和GLUT9 mRNA的表達(dá)水平,抑制了UA的重吸收,上調(diào)OAT1 mRNA表達(dá)水平,最終促進(jìn)多余的UA隨尿液排出體外。

本文除發(fā)現(xiàn)BLP可促進(jìn)尿酸排泄外,還發(fā)現(xiàn)BLP可極顯著促進(jìn)腸道排泄尿酸,但并未呈現(xiàn)出劑量依賴性。BLP的降尿酸作用還可能與其影響HUA小鼠的腸道菌群有關(guān),因其含有豐富的膳食纖維[18],而膳食纖維在體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌組成[29]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),HUA或痛風(fēng)與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)[30]。腸道內(nèi)菌群中存在一些能夠分解尿酸的細(xì)菌,可將尿酸進(jìn)一步分解為易于排出體外的尿囊素[31]。本文所研究的BLP可能同時影響了某些菌群的組成,改變了某些分解尿酸的細(xì)菌的豐度,使得更多尿酸經(jīng)細(xì)菌分解而直接以尿囊素的形式排出體外,因此本文未能在腸道尿酸中檢測到BLP的劑量效應(yīng)。此外,BLP還可能影響了腸道菌群代謝產(chǎn)物的含量,通過這類代謝產(chǎn)物發(fā)揮其降尿酸作用,如短鏈脂肪酸。目前本課題組正開展相關(guān)的工作,以期進(jìn)一步闡明BLP的降尿酸機(jī)制。

持續(xù)的高尿酸將損傷腎臟。本研究發(fā)現(xiàn)BLP在發(fā)揮降尿酸的作用時能逆轉(zhuǎn)高尿酸導(dǎo)致的血清CR與BUN水平升高,而別嘌呤醇并無此作用,表明BLP具有一定的腎臟保護(hù)作用。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)BLP可通過抑制體內(nèi)XOD活性減少體內(nèi)UA生成,同時下調(diào)URAT1、GLUT9,上調(diào)OAT1的表達(dá)從而促進(jìn)UA的排泄,最終表現(xiàn)出顯著的降尿酸與腎臟保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)可為開發(fā)BLP成為降尿酸功能性食品提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。