郅 慧,蘭 夢,李晶峰,張 曄,楊小倩,張 輝,*,李春楠,*(.長春中醫(yī)藥大學，吉林省人參科學研究院,吉林長春 307;.吉林鑫水科技開發(fā)有限公司,吉林長春 30000)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要表現(xiàn)的自身免疫疾病[1-2]。RA的反復發(fā)作,可引起關(guān)節(jié)軟骨的損害和侵蝕,造成關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。調(diào)查發(fā)現(xiàn),RA是一種致殘性疾病,高致殘率已經(jīng)嚴重影響人民的生活和健康[3-4]。臨床上常用的抗RA藥物價格昂貴,毒副作用大。因此,開發(fā)廉價、高效、副作用少的藥物成為科學家關(guān)注的熱點[5-7]。

鹿筋是梅花鹿CervusnipponTemminck的四肢干燥筋,是我國傳統(tǒng)的名貴動物藥,具有一定的藥用價值[8],同時可以用于食品、保健品等行業(yè)。鹿筋含有豐富的蛋白[9],現(xiàn)代研究表明鹿筋蛋白具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用,主治風濕關(guān)節(jié)痛、轉(zhuǎn)筋等癥[10-11],對維護機體正常功能和修復損傷作用顯著[12]。孫曉迪等[13]研究結(jié)果表明鹿筋膠原可顯著抑制大鼠足腫脹度及炎性細胞因子的分泌,抗炎作用顯著。曲毅等[14]研究結(jié)果表明鹿筋膠原蛋白能有效的抑制小鼠耳廓腫脹,降低炎性滲出,具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用。張鶴等[15]研究結(jié)果表明鹿筋膠原蛋白對骨質(zhì)疏松癥具有較好的防治作用。

類風濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(RAFLSs)在類風濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色,其中RAFLSs的作用包括炎癥因子的分泌、血管翳的生成、軟骨及軟骨下骨的侵蝕等[16]。MH7A細胞屬于類風濕性關(guān)節(jié)炎成纖維細胞(RAFLSs)的一種成熟的細胞系,其作用和RAFLS基本相同,與RAFLSs相比具有增殖速度快,不受傳代次數(shù)限制等特性。TNF-α作為一種促炎癥因子,貫穿RA發(fā)病的始終,目前認為TNF-α可誘導RAFLS發(fā)生凋亡機制障礙,從而導致RA病變持續(xù)存在、遷延發(fā)展[17-18],因此本實驗選擇TNF-α誘導MH7A細胞。NO、IL-6、TNF-α是RA炎癥反應中的關(guān)鍵效應因子,其分泌過量將產(chǎn)生炎性損傷[19-20],研究表明,RA患者的炎性反應發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用的是細胞炎癥因子的釋放,因此本實驗需要測定這三種炎癥因子的含量。目前大量抗類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物通過抑制炎癥細胞因子的釋放從而達到治療疾病目的。

為探討鹿筋蛋白抗RA活性,本研究以梅花鹿鹿筋為原料,優(yōu)化蛋白的提取工藝,并考察其對MH7A細胞的增殖抑制活性及炎癥因子分泌的影響,在細胞水平上探討鹿筋蛋白抗RA的作用,為鹿筋的開發(fā)應用提供了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅花鹿鹿筋 吉林省東鰲鹿業(yè)科技開發(fā)有限公司;細胞株(MH7A) 購自廣東吉尼歐生物技術(shù)公司;胎牛血清 美國Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素 美國Hyclone公司;TNF-α北京索萊寶科技有限公司;IL-6、TNF-α、NO試劑盒 長春百金生物科技有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

倒置顯微鏡 奧林巴斯工業(yè)有限公司;680 型酶標儀 上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司;紫外分光光度計 德國耶拿分析儀器股份有限公司;冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿筋前處理 將鹿筋剪成8 mm×8 mm小塊,用蒸餾水沖洗干凈,置-20 ℃冷凍保存。

1.2.2 鹿筋蛋白提取工藝 稱取一定量的鹿筋,加入到一定量的水中[21],磁力攪拌提取,提取過程中保持溫度恒定,過濾,收集濾液,測定蛋白含量。

1.2.3 鹿筋蛋白含量測定

1.2.3.1 標準曲線的測定 分別吸取蛋白質(zhì)標準溶液(1 mg/mL)10、20、40、60、80、100 μL置于試管中,用蒸餾水補足至1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍溶液,混勻,室溫靜置5 min。并設置空白對照(以蒸餾水作為空白對照),測定595 nm 處吸光度A值。將蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度(μg/mL)作為橫坐標(X),將A595作為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得線性回歸方程Y=5.0164X+0.0261,R2=0.9930,結(jié)果表明質(zhì)量濃度為10～100 μg/mL范圍內(nèi)時,蛋白質(zhì)標準溶液的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

1.2.3.2 樣品溶液的測定 稱取鹿筋蛋白凍干樣品,配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL樣品溶液,吸取1 mL樣品溶液加入5 mL考馬斯亮藍溶液,混勻,室溫反應5 min,測定595 nm處A值。根據(jù)公式(1)計算鹿筋蛋白含量。

式(1)

式中:c為供試品(樣液)溶液中的蛋白質(zhì)濃度(μg/mL);D為樣品溶液的稀釋倍數(shù);W樣為樣品質(zhì)量(μg)。

1.2.5 響應面試驗設計 結(jié)合單因素試驗結(jié)果,對提取時間、提取溫度、料液比進行三因素三水平的響應面試驗設計,試驗因素水平如表1所示。

表1 響應面優(yōu)化試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 鹿筋蛋白對MH7A增殖抑制活性及炎癥因子分泌的影響

1.2.6.1 細胞培養(yǎng) MH7A細胞用含10% 胎牛血清、1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期的細胞用于實驗[22]。

1.2.6.2 MTT法測定細胞增殖抑制率 將配制好的細胞5×104cell·mL-1懸液接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種100 μL,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h后造模(加入質(zhì)量濃度為60 ng/mL的 TNF-α溶液)繼續(xù)培養(yǎng)24 h給藥,每個濃度設5個復孔,于5% CO2、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL質(zhì)量濃度5 g·L-1的MTT溶液,培養(yǎng)4 h后棄上清液,加入150 μL DMSO,振蕩10 min,于490 nm波長處測其OD值,計算每組增殖抑制率。設置空白組(加DMEM高糖培養(yǎng)液)、TNF-α模型組(60 ng·mL-1TNF-α)、給藥組(25、50、100、200 μg·mL-1鹿筋蛋白+60 ng·mL-1TNF-α),實驗獨立重復3次[23]。

1.2.6.3 鹿筋蛋白對MH7A細胞釋放NO、IL-6、TNF-α水平的影響 細胞給藥培養(yǎng)24 h后,分別吸取上清液。采用ELISA試劑盒檢測NO、IL-6、TNF-α的含量水平,于490 nm測定吸光度OD值[24]。實驗獨立重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取時間對鹿筋蛋白含量的影響 由圖1可以看出,時間在2～12 h時,鹿筋蛋白含量隨著提取時間的延長而增加。在10 h時,蛋白含量最高,此時蛋白含量為10.04%。但提取時間在8～12 h范圍內(nèi),隨著提取時間的延長,鹿筋蛋白含量增長緩慢,10與12 h條件下的蛋白含量無統(tǒng)計學差異(P>0.05),考慮到節(jié)約人力物力等經(jīng)濟因素,因此確定下一步優(yōu)化范圍在7～9 h。

圖1 提取時間對鹿筋蛋白含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on deer gluten protein content 注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05);圖2～圖3同。

2.1.2 提取溫度對蛋白含量的影響 由圖2可以看出,溫度在30～100 ℃時,蛋白含量隨著提取溫度的升高而增加。80與90 ℃效果較好,100 ℃效果最好,100 ℃時蛋白含量顯著高于其它試驗組(P<0.05),但在100 ℃提取時,由于溫度太高,水分蒸發(fā)過快,為保持恒定的料液比,需要經(jīng)常補充水,且耗能較大,因此確定下一步優(yōu)化范圍在70～90 ℃。

圖2 提取溫度對蛋白含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on deer gluten protein content

2.1.3 料液比對蛋白含量的影響 由圖3可知,料液比在1∶10～1∶20 g/mL時,蛋白含量隨料液比的的增加而增加,在料液比為1∶20 g/mL時,其蛋白含量顯著高于其它試驗組(P<0.05),當超過1∶20 g/mL時,蛋白含量隨著料液比的增加而下降。因此確定下一步優(yōu)化范圍在1∶17～1∶23 g/mL。

圖3 料液比對鹿筋蛋白含量的影響Fig.3 Effect of feed-liquid ratio on deer gluten protein content

2.2 響應面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應面模型的建立與分析 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取的響應面試驗因素為料液比(A)、提取溫度(B)、提取時間(C),蛋白含量為響應值。根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理設計試驗,采用響應面法優(yōu)化鹿筋蛋白提取工藝。響應面試驗設計及結(jié)果見表2,ANOVA方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應面優(yōu)化試驗設計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸模型顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significant test and variance analysis for the regression model

運用Design Expert 8.0.6.1軟件對表3的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸分析,得鹿筋蛋白含量預測值(Y)對自變量A、B和C的二次多項回歸方程模型:Y=12.05+1.21A+0.77B+0.60C-0.30AB+0.70AC+1.30BC-1.50A2-0.87B2-1.54C2。

2.2.2 響應面交互作用分析與優(yōu)化 利用Design Expert軟件做不同因素間響應面分析圖與等高線圖。各因素的響應圖可直觀地反映各因素及其交互作用對蛋白得率大小的影響程度。其中等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強弱,圓形表示兩因素間交互作用較弱,橢圓表示兩因素間交互作用較強[25-26]。響應面圖和等高線圖見圖4～圖6。

圖4 料液比與提取溫度交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface map and contour map of interaction between material-liquid ratio and extraction temperature

圖5 料液比與提取時間交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface map and contour map of interaction between material-liquid ratio and extraction time

圖6 提取溫度與提取時間交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.6 Extraction of response surface and contour maps of interaction between temperature and extraction time

如圖4所示,隨著提取溫度的升高,蛋白含量先升高后降低。隨著料液比的增加,蛋白含量先升高后降低,等高線圖呈圓形,說明AB因素之間交互作用不顯著。如圖5所示,隨著提取時間及料液比的的增加,蛋白含量先升高后降低,說明在所選區(qū)域內(nèi)鹿筋蛋白含量存在極值,等高線圖呈橢圓形,說明AC因素之間存在顯著交互作用。如圖6所示隨著提取時間的增加及提取溫度的升高,蛋白含量先升高后降低,等高線圖呈橢圓形,說明BC因素之間存在顯著交互作用。

2.2.3 驗證試驗 通過軟件Design-Expert 8.0.6.1求解方程,計算得到蛋白得率達到最大值時的最優(yōu)提取工藝條件為:料液比1∶21.21 g/mL,提取溫度88.32 ℃,提取時間8.66 h,提取率預測值12.87%。為了便于進行試驗,對該條件進行修正:料液比1∶21 g/mL,提取溫度88 ℃,提取時間8.6 h。該條件下進行三次重復驗證實驗,取平均值,得鹿筋中蛋白含量為12.53%,與預測值相接近,為鹿筋蛋白的提取提供了良好的技術(shù)支撐。

2.3 鹿筋蛋白對 MH7A 細胞增殖抑制的影響

由表4可知，與空白組相比,TNF-α模型組細胞極顯著增殖(P<0.01),證明TNF-α模型造模成功;與TNF-α模型組相比,各給藥組均不同程度地抑制MH7A細胞的增殖。在200 μg/mL質(zhì)量濃度下,鹿筋蛋白抑制作用最高,增殖抑制率為78.93%,與模型相比有極顯著差異(P<0.01)。在50～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),細胞增殖抑制率隨著樣品濃度的增高而增高(P<0.01或P<0.001),呈現(xiàn)濃度依賴性,各樣品組與模型組相比有顯著性差異。綜上所述鹿筋蛋白對MH7A細胞增殖抑制活性結(jié)果為:200 μg/mL>100 μg/mL>50 μg/mL>25 μg/mL。

表4 各組細胞增殖抑制率 Table 4 Cell proliferation inhibitory rate in each group

2.4 鹿筋蛋白對MH7A細胞釋放NO、IL-6、TNF-α水平的影響

2.4.1 對MH7A細胞釋放NO的影響 如圖7所示,所示與空白組相比,TNF-α模型組可以極顯著誘導MH7A細胞分泌NO(P<0.01);與TNF-α模型組比較,各給藥組均可不同程度的下調(diào)MH7A細胞炎癥因子NO的水平。當質(zhì)量濃度達到100 μg/mL時,NO釋放量達到最低,效果高度顯著(P<0.001)。

圖7 各組細胞培養(yǎng)液中NO含量Fig.7 NO contents in culture medium in each group

2.4.2 對MH7A細胞釋放TNF-α的影響 如圖8所示,與空白組相比,TNF-α模型組可以極顯著誘導MH7A細胞分泌TNF-α(P<0.01);與TNF-α模型組比較,質(zhì)量濃度在25～200 μg/mL范圍內(nèi),各劑量組均可不同程度的下調(diào)TNF-α的水平,有極顯著差異(P<0.01)。經(jīng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL樣品處理后的MH7A細胞分泌TNF-α含量水平最低(P<0.01)。

圖8 各組細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量 Fig.8 TNF-α contents in culture medium in each group

2.4.3 對MH7A細胞釋放IL-6的影響 由圖9可知,與空白組相比,TNF-α模型組可以極顯著誘導MH7A細胞分泌IL-6(P<0.01);與TNF-α模型組比較,質(zhì)量濃度在25～200 μg/mL范圍內(nèi),各劑量組均可不同程度的抑制細胞釋放IL-6,有極顯著差異(P<0.01)。當質(zhì)量濃度達到100 μg/mL時,IL-6的釋放量達到最低,效果最顯著。

圖9 各組細胞培養(yǎng)液中IL-6含量 Fig.9 IL-6 contents in culture medium in each group

上述3個實驗結(jié)果一致,鹿筋蛋白能夠抑制MH7A細胞釋放細胞炎癥因子,在質(zhì)量濃度達到100 μg/mL時,細胞炎癥因子NO、IL-6、TNF-α釋放量達到最低,效果最佳。因此推測鹿筋蛋白對因炎癥因子過度釋放引起的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)損傷,具有良好的治療作用。

鹿筋蛋白對上述三種炎癥因子(NO、IL-6、TNF-α)抑制的最佳濃度為100 μg/mL,這與對細胞增殖抑制率的最佳濃度(200 μg/mL)不一致,推測是由于鹿筋蛋白對MH7A細胞發(fā)生的增殖抑制作用不單純是通過對這三種炎癥因子NO、IL-6、TNF-α的抑制發(fā)揮藥效,可能同時通過其他途徑來抑制MH7A細胞的增殖抑制率。

3 討論與結(jié)論

鹿筋蛋白常用的的提取方法為酸法提取,但酸法提取反應劇烈,反應過程難控制,影響生物活性,故本實驗采用熱水提取法提取鹿筋蛋白并對其活性進行研究,目前未見使用此法提取鹿筋蛋白。熱水提取過程中溫度的控制非常重要,提取溫度控制不當,提取不完全,產(chǎn)量會受到影響[27]。本實驗采用恒溫水浴磁力攪拌法提取鹿筋蛋白,既保證溫度的恒定,又加速浸提物的溶出。通過單因素試驗結(jié)果得出響應面優(yōu)化條件。鹿筋蛋白提取最佳條件為料液比1∶21 (g/mL),提取溫度88 ℃,提取時間8.6 h,測得蛋白含量為12.53%。

鹿筋具有補肝腎、強筋骨的功效,主治勞損過度、風濕關(guān)節(jié)痛等癥。本實驗考察了優(yōu)化工藝條件下提取所得的鹿筋蛋白對MH7A炎癥細胞增殖抑制的影響,并測定給藥后的MH7A細胞上清液中NO、IL-6、TNF-α的含量,驗證鹿筋蛋白抗RA活性。NO、IL-6、TNF-α是RA炎癥反應的重要指標。NO是一種重要的生物信使分子,低含量水平時,NO具有生理調(diào)節(jié)和抗炎的作用,高含量水平時,NO會加重炎癥反應。TNF-α、IL-6為炎癥細胞分泌的炎癥細胞因子,其中TNF-α具有很強的炎癥損傷作用,可產(chǎn)生級聯(lián)反應,促進IL-6細胞因子的釋放,加重炎癥反應[28]。

本實驗中,TNF-α誘導的模型組NO、IL-6、TNF-α炎癥效應因子分泌量分別為:4.07、21.95、16.31 pg/mL,在100 μg/mL質(zhì)量濃度下,鹿筋蛋白給藥組的炎癥驗證效應因子分別為:1.60、13.60、7.29 pg/mL,與模型組相比,鹿筋蛋白對上述三種炎癥因子釋放的抑制作用最顯著,由此推測鹿筋蛋白可能具有一定的抗RA活性。本研究采用60 ng/mL的TNF-α誘導MH7A細胞,結(jié)果表明,不同濃度的鹿筋蛋白對MH7A細胞增殖有抑制作用,且增殖抑制率隨藥物濃度的增加而增加,呈濃度依賴性。鹿筋蛋白質(zhì)量濃度為200 μg/mL時,對MH7A細胞的抑制作用最強,抑制率為78.92%。給藥后MH7A細胞上清液中NO、IL-6、TNF-α含量均有不同程度的降低,在質(zhì)量濃度達到100 μg/mL時,上述3種細胞炎癥因子釋放量達到最低,證明鹿筋蛋白的抗炎作用與其抑制炎癥因子的釋放密切相關(guān),進一步驗證了鹿筋蛋白具有較好的抗RA活性,但鹿筋蛋白抗RA活性并不是簡單的通過對三種炎癥因子(NO、IL-6、TNF-α)的抑制發(fā)揮效果,推測可能同時通過其他途徑來抑制MH7A細胞的增殖抑制率。

Majumder等[29]研究表明雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白可調(diào)節(jié)NF-κB炎癥信號通路中相關(guān)基因的表達、降低促炎細胞因子的釋放,從而達到抗炎活性。Huang等[30]研究表明雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白可通過抑制IκBα磷酸化阻斷NF-κB細胞信號通路,減少促炎因子的表達,上調(diào)抑炎因子表達,從而起到減輕致炎因子TNF-α誘導的細胞炎癥反應。Elvira Gonzalez等[31]研究表明在TNF-α誘導的細胞炎癥模型中,大豆蛋白能夠阻斷NF-κB信號通路激活,抑制NF-κB通路相關(guān)的p65和p50蛋白表達量,減少炎癥因子的釋放,從而減輕細胞炎性反應。鹿筋蛋白抗RA作用機制并不是簡單通過抑制MH7A細胞的增殖,抑制三種炎癥因子(NO、IL-6、TNF-α)的分泌發(fā)揮效果,鹿筋蛋白可能通過抑制MH7A細胞中炎癥信號轉(zhuǎn)導通路的激活,降低相關(guān)蛋白的表達,抑制炎癥因子NO、IL-6、TNF-α的分泌,加速炎癥細胞因子的清除,減少MH7A細胞的損傷,從而減輕RA炎癥反應,有待進一步研究。