彭 穎,黃 晴,李 珂(.長沙商貿旅游職業(yè)技術學院,湖南長沙 406;.湖南農業(yè)大學食品科學技術學院,湖南長沙 408)

小根蒜(AlliummacrostemonBunge)是一種藥食同源植物,多生長于我國大部分野外地區(qū),栽培較少[1-2]。作為一種野生蔬菜,小根蒜全株可作為食材,兼具蒜、蔥、藠的特殊風味,喜愛人群廣泛。小根蒜中存在多種游離氨基酸及烴的衍生物,具有各種風味并影響其作為食物和藥物的價值[3]。小根蒜的干燥鱗莖是一種傳統(tǒng)中藥材,稱為薤白,其抑菌、抗氧化、抗癌等藥理作用已獲得普遍認同[4]。目前國內外對薤白及其方劑的成分、藥理、臨床應用有大量的研究,研究發(fā)現薤白中含有甾體皂苷、含氮化合物、揮發(fā)油、甾體皂甙、多糖等多種化學成分,具有增強免疫力、降脂、抗氧化、抗菌、肝藥酶抑制、抗抑郁等多種藥理作用[5-7]。

完整的小根蒜并無明顯刺激性氣味,當其表皮遭到破壞時,才會散發(fā)出一股強烈的刺激性氣味。其特殊刺激性風味物質的形成,主要取決于揮發(fā)性物質的組成。對于揮發(fā)性物質的檢測,不同的前處理方式及檢測方法導致其檢測結果會有所差異。吳雁等人首次用GC-MS檢測方法對薤白揮發(fā)油進行了分析,鑒定了21種化合物,其中19種為含硫化合物,主要成分為二甲基三硫,甲基丙基三硫,甲基丙基二硫和丙基異丙基二硫[8]。也有研究者對薤白揮發(fā)油進行了檢測,發(fā)現主要成分為烯丙基甲基硫醚、二甲基二硫醚等小分子有機硫化物[9-10]。薤白為小根蒜的干燥鱗莖,為小根蒜的一部分,且小根蒜的莖葉同樣有食用及藥用價值,因此把小根蒜作為整體研究,更具科學意義。孫穎等人用SPME-液液萃取法分析小根蒜整體的揮發(fā)性風味物質,發(fā)現成分中含量較高的化合物為醚類(8.69%),其次是醛類(3.18%)和含硫化合物(2.83%)[11]。小根蒜中的有機硫化物含量雖少,但卻是小根蒜具有刺激性特殊氣味的主要原因。研究發(fā)現微生物發(fā)酵能有效去除生蒜的辛辣味及刺激性臭味,以改善口感[12],且在發(fā)酵過程伴隨著有機硫化物的轉變[13]。而有機硫化物作為蔥屬重要的生物活性物質,具有免疫活性,并參與氧化還原修飾[14-15],其前體大蒜素,也能提高抗免疫活性,預防炎癥性疾病[16]。含硫化物的組成不同,對其生理功能具有顯著影響。

發(fā)酵小根蒜是湖南湘西地區(qū)特色食品,長期以來主要在民間家庭采用傳統(tǒng)方式發(fā)酵制作,目前少數當地小型食品加工企業(yè)開展了小規(guī)模的生產并向市場推廣,但對發(fā)酵小根蒜的認識仍存在不足。綜合現有文獻發(fā)現,關于新鮮及發(fā)酵小根蒜的揮發(fā)性物質研究并不充分,特別是具有功能性的小根蒜特殊風味物質(有機硫化物)研究。因此,本文對比分析了小根蒜及其發(fā)酵產品中的揮發(fā)性物質,深入研究了揮發(fā)性物質中有機硫化物的抗氧化特性,為揭示發(fā)酵過程對特色風味形成、營養(yǎng)特性改變提供了重要參考依據,為充分開發(fā)發(fā)酵小根蒜地方特色食品,為湘西貧困地區(qū)發(fā)展食品產業(yè)帶動經濟發(fā)展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小根蒜花 垣縣苗漢子野生蔬菜開發(fā)專業(yè)合作社提供,產地湖南省花垣縣,樣品獲得后于-80 ℃儲存;無水乙醇、硝酸汞、三氯乙酸、硫酸高鐵銨、甲醇、甲酸、磷酸吡哆醛 國藥集團化學試劑有限公司;Ferrozine 上海瑞永生物科技有限公司;XAD-2樹脂 Sigma貿易有限公司;AB-8樹脂 天津市光復精細化工研究所;X-5樹脂 東鴻化工有限公司。

7890-5977B型氣相色譜-質譜儀 安捷倫科技有限公司;SQD2型液相色譜-質譜儀、ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱 Waters科技有限公司;FD-1A-50冷凍干燥機 上海精密儀器儀表有限公司;DBS-100全自動柱層析收集系統(tǒng) 上海滬西有限公司;AUY120電子分析天平、UV2450紫外分光光度計 島津分析技術研發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 新鮮小根蒜洗凈后瀝干水,切成2 cm小段,包裝密封并放置-20 ℃?zhèn)溆?。發(fā)酵小根蒜以新鮮小根蒜為原料,將切好的小根蒜置于密封容器中,25 ℃下自然發(fā)酵3個月。待色澤呈褐黃色并有濃郁酸味時即發(fā)酵完全,放置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

有機硫化物的提取工藝:根據文獻[17]方法,并加以改進。將新鮮及發(fā)酵小根蒜勻漿處理,密封,30 ℃下磷酸吡哆醛酶解30 min。以料液比1∶4 g/mL加入無水乙醇,混勻后于水浴40 ℃下,浸提1 h。然后以1000 r/min離心10 min,上清液即為粗提取液。取上清液于旋轉蒸發(fā)儀上旋轉蒸發(fā),真空條件下,溫度為40 ℃,快速旋轉蒸發(fā)至無乙醇味。濃縮后的粗提取液放入真空冷凍干燥機中干燥成粉。冷凍干燥條件為溫度-60 ℃,真空度為15 kPa,真空冷凍干燥時間16 h,樣品厚度不超過0.5 cm。

1.2.2 GC-MS檢測揮發(fā)性物質 分別取新鮮小根蒜與發(fā)酵小根蒜5 g于密封的樣品瓶中,加入萃取溶劑無水乙醇20 mL,水浴加熱至80 ℃,保持10 min,將萃取頭放入樣品瓶中,萃取吸附20 min,吸附結束后進樣氣相色譜-質譜儀。解析溫度270 ℃,解吸時間30 min,采集數據。色譜柱條件:DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),進樣口溫度為270 ℃。色譜柱升溫程序:50 ℃保持2 min,以5 ℃/min升溫,升溫至250 ℃,保持50 min,以25 ℃/min升溫,升溫至280 ℃,保持2 min。掃面范圍:30～450 amu,溶積延遲:0.5 min。質譜條件:EI離子源,電子能量60 eV,掃描范圍m/z:30～400,全離子掃描。譜圖檢索采用NIST2017譜庫,并按各峰的質譜裂片圖與文獻資料比對,確定主要化學成分;采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

1.2.3 有機硫化物的測定 比較3種有機硫化物含量測定方法在小根蒜樣品測定中的適用性,最終確定1種用于后續(xù)測定。3種不同的測定方法為:定硫法測定法[18]、分光光度法[19-20]、硝酸汞滴定法[21]。

1.2.4 有機硫化物提取得率的計算方法

1.2.4.1 有機硫化物得率

式中,m1為提取獲得的有機硫化物的質量(g);w1為小根蒜樣品的質量(g),以干重計。

1.2.4.2 有機硫化物提取物純度

式中,m2為純化后的小根蒜有機硫化物的量(g);w2為取樣重量(g),以干重計。

1.2.5 大孔樹脂層析柱純化 小根蒜有機硫化物組分取1.2.1步驟中制備的新鮮及發(fā)酵的小根蒜粗提取液上樣于玻璃層析柱,經大孔吸附樹脂分離純化,以獲得純度較高的有機硫化物組分。

1.2.5.1 靜態(tài)吸附-解吸試驗 選擇95%乙醇預處理XAD-2、AB-8、X-5三種樹脂。分別稱取三種樹脂各0.5 g于錐形瓶中,加入小根蒜粗提取液100 mL,溫度為30 ℃,振蕩頻率為100 r/min,振蕩吸附24 h后,測定溶液有機硫化物濃度,由以下公式計算樹脂的吸附量:

式中:C0為小根蒜粗提取液初始有機硫化物濃度(mg/mL);C為吸附平衡后的小根蒜粗提取液有機硫化物濃度(mg/mL);V為溶液體積(mL);M為樹脂重量(g)。

樹脂取出后,用水洗去雜質,然后加入95%乙醇30 mL,30 ℃、100 r/min下,恒溫振蕩。24 h后測定瓶中液體有機硫化物的含量。用以下公式計算樹脂的解吸率:

式中:C1為解吸液中有機硫化物濃度(mg/mL)。

為考察試驗條件對樹脂吸附能力的影響,分別選擇吸附時間(0.5～3.0 h)、粗提液pH(2.5～5.0)及解吸時乙醇的體積分數(50%～100%)為變量,固定其他條件(吸附時間2 h,pH4.0,乙醇體積分數80%)進行單因素實驗,以吸附量、解吸率為評價指標。

1.2.5.2 動態(tài)吸附-解吸試驗 取30 g樹脂于95%乙醇溶液浸泡,采用濕法裝柱,取小根蒜提取液(0.1 mg/mL)以3 BV上樣量,采用乙醇溶液(濃度為1.2.5.1優(yōu)化后得到的濃度)洗脫,設置流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min,分段收集流出液,考察洗脫速度對樹脂動態(tài)解吸率的影響。確定最佳洗脫流速后,再分別考察樹脂填充量及上樣量對樹脂解吸率的影響。樹脂填充量分別為5、10、15、20、25、30 g,上樣量分別為1、2、3、4、5、6 BV。收集各組提取純化液,進行冷凍干燥后,置于-20 ℃保存,備用。

式中:V1為解吸液的收集體積(mL)。

1.2.6 新鮮與發(fā)酵小根蒜中有機硫化物清除自由基能力的測定 新鮮及發(fā)酵小根蒜中的有機硫化物經分離純化,得到的各組分提取液用于抗氧化檢測。DPPH自由基清除能力的測定依據參考文獻[22-23]進行,以谷胱甘肽作為對照;Fe2+螯合能力的測定依據參考文獻[20]進行,以EDTA作為對照;·OH清除能力的測定依據參考文獻[24]進行,以維生素C作為對照;總還原力的測定依據參考文獻[25]進行,以維生素C作為對照。

1.3 數據處理

實驗結果以Origin 8.5以及SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,結果均以平均值±標準差表示。應用LSD或鄧肯分析比較每組均值,當P<0.05時,被認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 小根蒜中揮發(fā)性物質測定結果

從表1可知,2種小根蒜樣品共檢測到揮發(fā)性物質39種,新鮮小根蒜中檢出27種,發(fā)酵后的小根蒜中檢出23種,經過發(fā)酵后,小根蒜中的揮發(fā)性物質發(fā)生復雜的變化,有16種揮發(fā)性物質消失,新增12種,1種揮發(fā)性物質含量增加(3-甲基丁醛),10種含量減少。小根蒜中揮發(fā)性物質由醛、醇、酯、酸及有機硫化物組成。新鮮小根蒜中有4類物質,包括醛類物質8種(33.8%),醇類物質2種(12.32%),其余為酯與酮。發(fā)酵小根蒜中有5類物質,其中醇類物質11種(49.46%),酸類物質只有1種,為乙酸(41.32%),酯類2種(6.67%),醛類物質2種(0.98%),其中一種含硫。

表1 小根蒜中的揮發(fā)性物質Table 1 Volatile substances in Allium macrostemon Bunge

小根蒜的發(fā)酵過程是醛類物質向醇類物質和酸類物質的轉變。相對于新鮮小根蒜,發(fā)酵小根蒜中醇類物質中的甲醇、乙醇含量降低,丙醇、丁醇含量大幅提高,其中2-丁醇含量最高(15.12%);醛類物質大量減少,丙醛、戊醛、己醛已完全轉化分解。微生物發(fā)酵的代謝途徑主要有醋酸、乙醇、乳酸、檸檬酸發(fā)酵,前期糖代謝可以為微生物提供發(fā)酵原料[26],在酵母菌的發(fā)酵下,乙醛被還原為乙醇,實現了醛類物質向醇類物質的轉變;而好氧型的醋酸菌能將乙醇轉化為乙酸,另外乳酸菌發(fā)酵也可能產生乙酸[27],所以新增了大量的乙酸。

新鮮小根蒜中的有機硫化物種類多于發(fā)酵后的小根蒜,新鮮小根蒜中含有15種有機硫化物,占全部揮發(fā)性物質的52.11%,其中10種直鏈硫醚類物質中,含烯丙基、丙烯基的有機硫化物分別有兩種,含環(huán)狀的有機硫化物有4種。發(fā)酵后的小根蒜中含有8種有機硫化物,占全部揮發(fā)性物質1.66%,環(huán)狀有機硫化物幾乎全部分解消失。另外在發(fā)酵過程中,烯丙基、丙烯基來源于蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜,S-allyl-L-cysteine sulfoxide,SACS)、異蒜氨酸(S-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜,isoalliin),這兩種有機硫化物雙鍵斷裂,分解成為二烯丙基硫化物(Diallyl sulfide,DAS)、二烯丙基二硫化物(Diallyl disulfide,DADS)等?？寡趸矫?新鮮小根蒜中含有丙烯基、烯丙基等的有機硫化物,其抗氧化性已有文獻報道證實[28]。除此之外,還有噻吩類等物質,這一類物質及其衍生物的抗氧化性等生物學功能目前仍處于研究階段。

小根蒜在發(fā)酵前后,其揮發(fā)性物質組成不同,是發(fā)酵小根蒜的風味不同于新鮮小根蒜的原因。蒜在細胞破碎后,有機硫化物前體物質在酶的作用下發(fā)生降解反應,生成大蒜素。大蒜素在常溫或光照下緩慢降解,得到終產物硫醚類等有機硫化物[29]。蔥屬植物因含有大蒜素,通常具有標志性的辛辣味。新鮮小根蒜也含有這種辛辣味,同時散發(fā)出類似蔥的清香味。但經過發(fā)酵后,小根蒜中的有機硫化物在微生物的作用下分解、轉化,發(fā)生了顯著變化,最后與酸類物質形成了和諧的特殊氣味[30],這種特殊且又柔和的氣味也將是發(fā)酵小根蒜產品的一大特色。

2.2 不同方法測定的有機硫化物得率

定硫法檢測的是含有亞砜基的一類物質[18],分光光度法檢測的是含有巰基的半胱氨酸類活性的有機硫化物[19-20],硝酸汞滴定法檢測的是含有硫離子的化合物[21]。從圖1所示,硝酸汞滴定法測得小根蒜中的有機硫化物含量最高,其次是分光光度法,檢測得率最小的是定硫法。根據之前的參考文獻[21],采用硝酸汞滴定法測定大蒜中的有機硫化物精密度試驗,結果顯示該方法的精密度良好。說明硝酸汞滴定法在本試驗中用于檢測有機硫化物具有穩(wěn)定、可靠、易被檢測到的優(yōu)勢,因而后續(xù)測定小根蒜中有機硫化物采用硝酸汞滴定法。

圖1 不同方法測定的有機硫化物得率Fig.1 Yield of organic sulfide determined by different methods注:**表示與定硫法相比,有極顯著差異(P<0.01)。

2.3 靜態(tài)吸附試驗結果

2.3.1 樹脂篩選結果 從表2可以看出XAD-2在吸附量與解析率都明顯領先于X-5,且優(yōu)于AB-8大孔吸附樹脂,所以試驗選擇XAD-2大孔吸附樹脂作為粗提液中有機硫化物分離純化的材料。

表2 樹脂吸附量及解吸率Table 2 Adsorption and desorption rate of resin

2.3.2 吸附時間對吸附效果的影響 由圖2可知,XAD-2大孔樹脂對有機硫化物的吸附能力隨著吸附時間增加逐步減緩,在2.5 h后趨于飽和,因此選擇2.5 h的吸附時間繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

圖2 樹脂在不同吸附時間下對有機硫化物吸附量的影響Fig.2 Effect of adsorption time on the adsorption of organic sulfide

2.3.3 pH對吸附效果的影響 由圖3可以發(fā)現當pH為3.5,即液體原pH時,XAD-2對有機硫化物的吸附量最高,隨著pH的繼續(xù)增加,吸附量卻在不斷降低,因此pH選擇為3.5。

圖3 不同pH對有機硫化物吸附量的影響Fig.3 Effect of different pH on the adsorption of organic sulfide

2.3.4 乙醇體積分數對解吸效果的影響 由圖4可知,解吸率隨著乙醇體積分數的增高而增高,在90%乙醇以上增長緩慢,無水乙醇時解吸率最高,考慮到樹脂預處理選用的是95%的乙醇,且無水乙醇更易揮發(fā),而造成實驗因素不穩(wěn)定,因而選用95%體積分數的乙醇。

圖4 不同乙醇體積分數對有機硫化物解吸率的影響Fig.4 Effect of different volume fraction of ethanol on desorption rate of organic sulfides

2.4 動態(tài)解吸試驗結果

2.4.1 流速對解吸效果的影響 由圖5可知,解吸率隨流速的增高而降低,在吸附時間足夠的情況下,流速促使有機硫化物從樹脂中洗脫,慢流速讓有機硫化物在樹脂中擴散洗脫,有利于分離,但洗脫管數相應增加,造成有機硫化物在此過程中的損失。有機硫化物的解吸率在流速為0.5和1.5 mL/min之間較高,為了減少有機硫化物在解吸過程中的損失,且盡可能地得到分離,因此選擇流速為1.5 mL/min的條件較優(yōu)。

圖5 不同流速對有機硫化物解吸率的影響Fig.5 Effect of different velocity on the desorption rate of organic sulfide

2.4.2 樹脂填充量對解吸效果的影響 由圖6可知,在固定其他條件下,樹脂填充量越多,解吸率越低。但樹脂填充量太少時,不利于洗脫液流速的控制,對上樣量也有影響。為保證樹脂能在60%以上的解吸率,且對上樣量及洗脫流速無顯著影響,因此選擇樹脂填充量為15 g。

圖6 不同樹脂填充量對有機硫化物解吸率的影響Fig.6 Effect of different resin filling amount on the desorption rate of organic sulfide

2.4.3 上樣量對解吸效果的影響 由圖7可知,在同等床體積條件下,上樣量在3 BV時,解吸率最高,達到93.47%。上樣量的繼續(xù)增長降低了其解吸率,可能因其吸附量達到飽和,隨之解吸率降低。

圖7 不同上樣量對有機硫化物解吸率的影響Fig.7 Effect of different sample volumes on the desorption rate of organic sulfide

2.5 分離純化后小根蒜中總有機硫化物得率

圖8 新鮮小根蒜(A)和發(fā)酵小根蒜(B)中有機硫化物的分離結果Fig.8 Separation result of organic sulfides from fresh Allium macrostemon Bunge(A)and fermented Allium macrostemon Bunge(B)

采用無水乙醇,在溫度30 ℃、時間30 min、料液比為1∶4條件下對小根蒜進行浸提,得到有機硫化物組分,上樣于層析柱,樹脂填充量為15 g,上樣量為3 BV,流速為1.5 mL/min,分離純化得到有機硫化物組分。新鮮小根蒜提取物獲得的總有機硫化物得率為7.7 mg/g,其純度為65.72%。發(fā)酵小根蒜提取物中有機硫化物的總得率為8.3 mg/g,其純度為65.72%。

2.6 對有機硫化物組分分離純化效果

新鮮小根蒜的分離管數達到100管,大致得到10個組分,其中第二個與第三個組分未分離完全,分離組分最佳的是第五個組分。小根蒜中的有機硫化物種類多,想要得到單個組分較為困難。

發(fā)酵小根蒜中有機硫化物的分離管數達80管,分離為9個組分,其中第3和第4個組分未分離完全,第6個與第7個組分分離不明顯。

2.7 小根蒜有機硫化物各組分清除自由基能力

新鮮及發(fā)酵小根蒜的分離液中每個組分測定其清除自由基能力,結果如表3和表4。新鮮小根蒜中清除DPPH自由基能力最好的為第1個組分(56.13%),Fe2+螯合能力最好的為第5個組分(54.82%),·OH最好的為第2個組分(83.12%),總還原能力最好的為第9個組分(0.186),綜合4個清除自由基能力的測定結果,抗氧化性最強的為第2個組分。

表3 新鮮小根蒜中各組分的清除自由基能力Table 3 Scavenging free radical ability of each component in fresh sample

表4 發(fā)酵小根蒜中各組分的清除自由基能力Table 4 Scavenging free radical ability of each component in fermented sample

發(fā)酵小根蒜中清除DPPH自由基能力最好的為第1個組分(60.99%),Fe2+螯合能力最好的為第9個組分(43.40%),·OH自由基清除能力最好的為第3個組分(72.11%),總還原能力最好的為第1個組分(0.195),綜合4個清除自由基能力的測定結果,抗氧化性最強的為第1個組分。在DPPH自由基清除能力和總還原能力方面,發(fā)酵小根蒜優(yōu)于新鮮小根蒜。

新鮮及發(fā)酵小根蒜在清除自由基能力的抗氧化性方面,顯著(P<0.05)低于陽性對照,說明小根蒜中的有機硫化物在抗氧化性的能力體現不在于直接清除自由基,以DPPH自由基清除能力為例,DPPH·可與H·形成分子,或接受電子,從而清除DPPH自由基[31],而有機硫化物上的分子結構多以雙鍵、二硫鍵、環(huán)狀結構,所以在清除自由基能力上較弱。

3 討論與結論

本文采用GC-MS對新鮮小根蒜及其發(fā)酵產品中的揮發(fā)性物質進行對比研究,發(fā)現在新鮮小根蒜中檢出了27種物質,主要為醛類物質;在發(fā)酵產品中檢出23種,主要為醇類和酸類物質。這些變化主要通過乳酸菌、醋酸菌等能夠產酸的細菌代謝形成,且醛類物質在發(fā)酵過程中被還原形成醇類物質,伴隨著酯類物質的生成,因此發(fā)酵產品產生了獨特的香味。這種發(fā)酵過程正如沙蔥的自然發(fā)酵,主要為酒精發(fā)酵和異型乳酸菌發(fā)酵[32]。

通過進一步研究小根蒜中的有機硫化物的分離提純方法,確定了硝酸汞滴定法是測定小根蒜中有機硫化物的最佳方法,用XAD-2大孔吸附樹脂作為小根蒜粗提液中有機硫化物分離純化的材料,在樹脂填充量為15 g,上樣量為3 BV,流速為1.5 mL/min下,分離純化效果達最優(yōu)。這種方法與柏冬等人純化大蒜總皂苷的工藝相似[33]。

小根蒜中的生物活性物質主要為有機硫化物[34],通過比較有機硫化物純化后的各組分體外清除自由基能力,發(fā)現各組分有機硫化物的抗氧化效果存在顯著差異。各組分經分離純化后,其有機硫化物純度雖顯著提高,但仍為混合物,無法確定是哪種有機硫化物的作用。同時,提取工藝的不同,導致有機硫化物的組分也有差異[35],因此對不同自由基的清除能力也略有不同。

因此,未來將進一步分離這一混合物,驗證體外抗氧化活性最好的有機硫化物單體物質,以及其在生物體內的整體抗氧化性,促進小根蒜有機硫化物的進一步開發(fā)利用,這將對小根蒜特色產品的開發(fā)及醫(yī)學藥用有重要意義。