周康奇，潘賢輝，黃 姻，覃俊奇，徐俊龍，杜雪松，文露婷，陳 忠，潘志忠，鄧 潛，林 勇

(1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西水產(chǎn)良種南繁基地，廣西 南寧 530021； 2.廣西欽州農(nóng)業(yè)學(xué)校，廣西 欽州 535000)

微衛(wèi)星(Microsatellite)或稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeats,SSR)，具有分布廣泛、多態(tài)性高、共顯性遺傳以及擴(kuò)增穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于物種遺傳育種、種質(zhì)資源評(píng)定、遺傳圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀座位(Quantitative trait locus,QTL)分析等研究領(lǐng)域[1-2]。高度可變的微衛(wèi)星區(qū)域可以提供更加精細(xì)的群體水平動(dòng)態(tài)變化的分辨率，適合用于保護(hù)遺傳學(xué)、種質(zhì)資源鑒定、種群遺傳多樣性、種群關(guān)系、性狀遺傳分析和進(jìn)化等研究[3-4]。與傳統(tǒng)SSR分析方法相比，RNA-seq二代測(cè)序技術(shù)具有便捷、高效、通量大等優(yōu)勢(shì)，目前已成為大規(guī)模開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的有效方法，已在牙鲆(Pralichthysolivaceus)[5]、黃姑魚(yú)(NibeaalbifloraRichardson)[6]、黃唇魚(yú)(Bahabaflavolabiata)[7]、銀鲴(Xenocyprisargentea)[8]等魚(yú)類上廣泛應(yīng)用。

奧利亞羅非魚(yú)(Oreochromisaurea)隸屬于鱸形目(Perciformes)、麗魚(yú)科(Cichlidae)、羅非魚(yú)屬(Oreochromis)，是羅非魚(yú)中的大型種類，因其具有適鹽性廣、生長(zhǎng)快、易繁殖、肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)勢(shì)，備受廣大消費(fèi)者和養(yǎng)殖戶的喜愛(ài)，如今是羅非魚(yú)主要養(yǎng)殖品種之一[9]。目前，關(guān)于奧利羅非魚(yú)的研究多在遺傳結(jié)構(gòu)和核型分析[10-11]、性別機(jī)制探索[12-14]、耐寒性能[15]、肉質(zhì)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)[16-17]等方面，但也有少數(shù)學(xué)者對(duì)奧利亞羅非魚(yú)不同鹽度條件下的養(yǎng)殖進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)奧利亞羅非魚(yú)可以在低于20‰鹽水中生存，且日增體質(zhì)量超過(guò)1 g[18-19]。據(jù)此，有學(xué)者認(rèn)為只要控制好養(yǎng)殖條件，可以在鹽水中養(yǎng)殖奧利亞羅非魚(yú)，并能獲得較好品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益[18-19]。

目前，在海南、廣西、廣東等沿海地區(qū)，已有養(yǎng)殖戶在天然海水中成功養(yǎng)殖奧利亞羅非魚(yú)，并取得良好的經(jīng)濟(jì)效益[20]。耐鹽羅非魚(yú)傳統(tǒng)選育存在培育周期長(zhǎng)、投入成本高等瓶頸問(wèn)題，因此，結(jié)合現(xiàn)代生物分子技術(shù)選育耐鹽羅非魚(yú)成為一種高效選育手段。為此，筆者所在課題組采用RNA-seq測(cè)序方法，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法挖掘有關(guān)奧利亞羅非魚(yú)耐鹽性能的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，同時(shí)深入探討其組成特點(diǎn)與分布規(guī)律，旨在為開(kāi)發(fā)有效的輔助育種分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院的廣西水產(chǎn)良種南繁基地開(kāi)展為期3個(gè)月鹽度養(yǎng)殖試驗(yàn)，從鹽度組中隨機(jī)選取30尾奧利羅非魚(yú)，取其肝臟和脾臟組織置于RNA保護(hù)液中[生工生物工程(上海)股份有限公司]，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取和cDNA文庫(kù)構(gòu)建

根據(jù)Trizol試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))的操作說(shuō)明提取總RNA。RNA完整性和濃度分別通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和2 100安捷倫生物分析儀(Agilent公司，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)RNA完整性數(shù)(RIN)大于8，且存在完整28S和18S核糖體條帶時(shí)，可用于構(gòu)建RNA-seq文庫(kù)。等量混合每個(gè)個(gè)體RNA樣品后，按照LI等[21]的方法進(jìn)行cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。

1.3 RNA測(cè)序和拼接組裝

利用Illumina HiSeq 4 000測(cè)序平臺(tái)(廣州基迪奧生物科技有限公司，中國(guó))進(jìn)行高通量測(cè)序。并通過(guò)Assembly A Perl程序?qū)aw date轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭序列和低質(zhì)量的Reads(基礎(chǔ)質(zhì)量<20)。采用Trinity軟件組裝方法對(duì)序列進(jìn)行拼接獲得轉(zhuǎn)錄組序列，然后所有測(cè)序讀段通過(guò)De novo組裝產(chǎn)生單一序列和重疊群。

1.4 SSR位點(diǎn)分析和篩選

按照以下配置參數(shù)使用軟件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對(duì)轉(zhuǎn)錄組的所有 Unigene進(jìn)行搜索，并鑒定SSR。配置參數(shù)信息：二核苷酸重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)≥6次，三核苷酸單元?jiǎng)t重復(fù)數(shù)≥5次，四、五和六核苷酸單元重復(fù)次數(shù)≥4次；同時(shí)，2個(gè)SSR序列的距離短于100 bp則合并作為1個(gè)SSR位點(diǎn)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中SSR的數(shù)量及分布

將初始reads進(jìn)行嚴(yán)格數(shù)據(jù)質(zhì)控獲得高質(zhì)量clean reads共41 292 300個(gè)，平均GC含量為48.94%，Q20和Q30堿基百分比分別超過(guò)98.88%和94.80%，表明本研究中RNA-seq測(cè)序所得數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。通過(guò)組裝、聚類和拼接，取得了平均長(zhǎng)度為1 097 bp，共計(jì)71 009條的Unigenes序列，合計(jì)全長(zhǎng)為77 936 593 bp。

運(yùn)用MISA軟件對(duì)獲得的所有Unigenes序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)檢索，共發(fā)現(xiàn)了10 875個(gè)SSR位點(diǎn)，含有SSR位點(diǎn)的Unigenes序列(約占11.71%)有8 315條。其中，含有SSR位點(diǎn)1個(gè)以上序列數(shù)量有1 844條，存在復(fù)合形式的SSR位點(diǎn)數(shù)量有821個(gè)。此外，在奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中存在較為豐富的SSR位點(diǎn)類型，共發(fā)現(xiàn)5種核苷酸重復(fù)類型(即二到六個(gè)核苷酸重復(fù))，但是不同核苷酸重復(fù)類型的占比差異比較大，二、三和四核苷酸的SSR位點(diǎn)類型占總位點(diǎn)數(shù)的95.90%，而五、六核苷酸SSR位點(diǎn)數(shù)量占比只有4.10%。其中，數(shù)量最多的是二核苷酸SSR位點(diǎn)，為5 779個(gè)，約占總數(shù)的53.14% ；三核苷酸和四核苷酸SSR位點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為3 281個(gè)(30.17%)和1 369個(gè)(12.59%)；五核苷酸和六核苷酸SSR位點(diǎn)數(shù)量很少，分別為389個(gè)(3.58%)和57個(gè)(0.52%)。另外，從5個(gè)類型的SSR位點(diǎn)的序列長(zhǎng)度上看，從大到小依次為二、三、四、五和六核苷酸，每種類型位點(diǎn)的平均長(zhǎng)度是20.12 bp，每種類型的SSR位點(diǎn)平均長(zhǎng)度分別是23.49、15.15、17.21、21.92、22.84 bp(表1)。從整體分布來(lái)說(shuō)，奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中每1個(gè)SSR位點(diǎn)平均相距約7.17 kb，即平均分布密度約為139個(gè)/Mb SSR位點(diǎn)。

表1 奧利亞羅非魚(yú)SSR位點(diǎn)的分布情況

按照WEBER[22]的分類方法可在奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中找到5種完美型的SSR位點(diǎn)，即完美二堿基重復(fù)(p2)、完美三堿基重復(fù)(p3)、完美四堿基重復(fù)(p4)、完美五堿基重復(fù)(p5)和完美六堿基重復(fù)(p6)類型，其中p2、p3分布數(shù)量最多，分別為91.35、49.64 kb，其次是p4、p5，分別為23.16、8.45 kb，而p6數(shù)量最少為1.28 kb，完美型SSR位點(diǎn)數(shù)約0.01個(gè)/Mb。

2.2 奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組SSR特點(diǎn)

依據(jù)奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中的不同類型SSR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)分布，發(fā)現(xiàn)6次重復(fù)數(shù)量最多，有3 048個(gè)SSR位點(diǎn)，占總數(shù)的27.77%；其次是5次重復(fù)數(shù)，達(dá)2 292個(gè)，占總數(shù)的20.89%；而7次重復(fù)數(shù)(1 500個(gè)，13.67%)和4次重復(fù)數(shù)(1 260個(gè)，11.48%)分別位于第2和第4(表2)。統(tǒng)計(jì)4～14次重復(fù)數(shù)的位點(diǎn)共存在10 189個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的92.85%，而大于或等于15次重復(fù)數(shù)位點(diǎn)合計(jì)785個(gè)，占比7.15%。

表2 奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中不同類型SSR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)分布

另外，統(tǒng)計(jì)奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)類型出現(xiàn)頻率，結(jié)果顯示,在總SSR位點(diǎn)中共有126個(gè)不同串聯(lián)重復(fù)單元類型，從二核苷酸到六核苷酸重復(fù)類型分布依次是4、10、29、50、33種類型。其中，AC/GT和AG/CT二核苷酸類型各出現(xiàn)3 954次和1 116次，具有明顯優(yōu)勢(shì)，分別占總SSR位點(diǎn)數(shù)量的36.36%和10.26%；三核苷酸類型中以AGG/CCT重復(fù)類型最多，共出現(xiàn)749次，約占總數(shù)的6.89%，隨后依次是AGC/CTG和AAT/ATT類型，各出現(xiàn)571次(5.25%)和503次(4.63%)；而四核苷酸和五核苷酸類型分別以AAAC/GTTT(441次，4.06%)和AAAAC/GTTTT(91次，0.84%)重復(fù)類型為主。剩余重復(fù)單元類型出現(xiàn)次數(shù)和頻率均比較低(圖1)。

圖1 奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中SSR主要重復(fù)單元的類型及出現(xiàn)頻率Fig.1 Types and frequency of SSR major repeat units in Oreochromis aurea transcriptome

2.3 奧利亞轉(zhuǎn)錄組SSR多態(tài)性評(píng)價(jià)

通過(guò)分析奧利亞羅非魚(yú)SSR位點(diǎn)長(zhǎng)度分布發(fā)現(xiàn)，所統(tǒng)計(jì)的SSR位點(diǎn)均分布在12～254 bp，其中，長(zhǎng)度在12～20 bp(不含20 bp)的位點(diǎn)個(gè)數(shù)最多，為8 462個(gè)(占比70.86%)；而處于20 bp以上(含20 bp)的SSR位點(diǎn)個(gè)數(shù)為3 480個(gè)，占總數(shù)的29.14%。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度小于12 bp的SSR位點(diǎn)。依據(jù)TEMNYKH等[23]的研究，可將SSR位點(diǎn)區(qū)分為Ⅰ和Ⅱ類，即Ⅰ類為高度多態(tài)性(堿基數(shù)≥20 bp)；Ⅱ類則為中等多態(tài)性(12 bp≤堿基數(shù)<20 bp)。推測(cè)奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)以中等多態(tài)性為主，其次是高度多態(tài)性。這2種類型的SSR位點(diǎn)均具有較高開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)RNA-seq二代測(cè)序技術(shù)對(duì)無(wú)參物種奧利亞羅非魚(yú)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SSR位點(diǎn)分析，在71 009條Unigenes上識(shí)別到10 875個(gè)SSR位點(diǎn)，不含單核苷酸類型位點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中含有SSR位點(diǎn)的Unigenes數(shù)量占總數(shù)的11.71%，低于黃唇魚(yú)(30.23%)[7]和牙鲆(27.12)[5]，高于鱈魚(yú)(Lotalota)(10.27%)[24]和銀鯧(Pampusargenteus)(2.62%)[25]，說(shuō)明奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中含有SSR位點(diǎn)較為豐富。另外，本研究還評(píng)估了SSR位點(diǎn)在Unigene上平均分布距離為7.17 kb，遠(yuǎn)大于牙鲆(2.95 kb)[5]、巨魾(Siluriformes:Sisoridae)(2.0 kb)[26]和鱈魚(yú)(4.25 kb)[24]，表明未統(tǒng)計(jì)單核苷酸數(shù)量影響了奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)分布密度。從SSR位點(diǎn)多態(tài)性來(lái)看，本研究發(fā)現(xiàn)了29.14%的Ⅰ類高度多態(tài)性和70.86%的Ⅱ類中等多態(tài)性位點(diǎn)，而未發(fā)現(xiàn)極低多態(tài)性位點(diǎn)(<12 bp)。李超等[5]運(yùn)用RNA-seq測(cè)序技術(shù)在牙鲆轉(zhuǎn)錄組中共識(shí)別Ⅰ類、Ⅱ類和極低多態(tài)性SSR位點(diǎn)，3類位點(diǎn)占比依次為65.10%、21.84%和13.05%。劉磊等[25]在銀鯧轉(zhuǎn)錄組中獲得了45.06%的Ⅰ類位點(diǎn)，31.89%的Ⅱ類位點(diǎn)和23.05%的極低多態(tài)性位點(diǎn)。依據(jù)本研究結(jié)果，推測(cè)奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中所含SSR位點(diǎn)多態(tài)性屬于中等以上水平[27]。同時(shí)，經(jīng)過(guò)多態(tài)性數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)檢測(cè)時(shí)不記錄單核苷酸重復(fù)單元類型位點(diǎn)可以避免篩選到極低多態(tài)性位點(diǎn)，但也漏選了部分中高等多態(tài)性的單核苷酸位點(diǎn)。大部分研究者將重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)高低作為評(píng)價(jià)SSR位點(diǎn)多態(tài)性的重要指標(biāo)之一，在奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中6次重復(fù)出現(xiàn)頻率最高，而后隨著重復(fù)次數(shù)的增加，SSR位點(diǎn)數(shù)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。有學(xué)者認(rèn)為，SSR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)發(fā)生變化，是SSR位點(diǎn)序列在DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)滑移導(dǎo)致原序列長(zhǎng)度增加而形成的，這可能在物種進(jìn)化過(guò)程中受到了自然選擇壓力的作用[28-29]。而對(duì)于基因結(jié)構(gòu)而言，重復(fù)次數(shù)的不斷變化會(huì)導(dǎo)致基因序列上堿基的移碼突變，進(jìn)而直接影響基因功能，這也是目前物種進(jìn)化、遺傳變異等研究?jī)?nèi)容中的熱點(diǎn)話題。

在對(duì)奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，二核苷酸AC/GT重復(fù)基元類型占主要優(yōu)勢(shì)(36.36%)，其次是AG/CT重復(fù)類型(10.26%)。類似的研究結(jié)果在其他魚(yú)類上也有發(fā)現(xiàn)，前人采用EST-SSR分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)對(duì)草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AC/GT類型的SSR位點(diǎn)分布最廣(分別為60.19%和50.30%)，AG/CT類型次之(分別為28.16%和40.40%)[30-31]；LI等[32]運(yùn)用RNA-seq測(cè)序技術(shù)在大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)上進(jìn)行研究，結(jié)果表明，AG/CT類型出現(xiàn)頻率高(18.17%)，其次為AG/CT(10.42%)。以上結(jié)果說(shuō)明，AC/GT和AG/CT重復(fù)單元類型普遍存在魚(yú)類中，但這種相似結(jié)果出現(xiàn)的原因還有待進(jìn)一步探索。此外，本研究中，三核苷酸以AGG/CCT、AGC/CTG和AAT/ATT等3種重復(fù)單元類型為主，而在不同的魚(yú)類上三核苷酸的主要重復(fù)類型存在差異，如在銀鯧上是以AAT/CAG、GAG/AAC和AAT/CCT為主[25]；在牙鲆上則以AGC、AAG和AAT為主[33]；在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)主要分布著AAT、AAG和AAC重復(fù)單元類型[34]。這表明三核苷酸重復(fù)基序除了形成了不同的DNA結(jié)構(gòu)外，還可能在重復(fù)的起源中產(chǎn)生物種特異性細(xì)胞因子[29]。

綜上，本研究運(yùn)用RNA-seq測(cè)序技術(shù)首次對(duì)奧利亞羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行鑒定獲得了一批中等水平以上的多態(tài)性SSR位點(diǎn)標(biāo)記，運(yùn)用性高、位點(diǎn)類型豐富、覆蓋了整個(gè)奧利亞羅非魚(yú)的基因組；而且對(duì)奧利亞羅非魚(yú)SSR位點(diǎn)的分布特征進(jìn)行了歸納統(tǒng)計(jì)分析，為奧利亞羅非魚(yú)遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳結(jié)構(gòu)分析等遺傳學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，為奧利亞羅非魚(yú)耐鹽家系人工輔助育種分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供了可靠的數(shù)據(jù)資料。