郭振華，阮海宇，喬松林，張改平,,3

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

早在1976年就有利用豬口腔液開展豬瘟病毒檢測的相關(guān)報(bào)道，但直到2010年以來，人們才開始系統(tǒng)研究口腔液作為一種生物檢測材料在豬群疫病診斷及健康監(jiān)測中的應(yīng)用[1-4]。豬口腔液主要是豬口腔中唾液和血清滲出液的混合液體，其中唾液主要是由大小唾液腺分泌的混合液體，而血清滲出液是通過口腔黏膜和口腔黏膜上的齒齦溝和毛細(xì)血管進(jìn)入口腔的[5-6]。大量的研究結(jié)果顯示，目前常見的豬病原微生物大多可在口腔液中檢測到核酸或者抗體[7-9]。與傳統(tǒng)的血清和組織樣本相比，口腔液具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，包括對豬群無應(yīng)激、節(jié)省勞動(dòng)力、效率高和經(jīng)濟(jì)成本較低等。目前，我國在利用口腔液開展豬群疫病監(jiān)測方面的研究報(bào)道還相對較少[10-11]。

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是影響生豬生產(chǎn)的重要病原，可以引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、間質(zhì)性肺炎、腸道疾病和繁殖障礙等[12]。PCV2屬于圓環(huán)狀病毒科(Circoviridae)圓環(huán)狀病毒屬(Circovirus)，基因組為單股環(huán)狀DNA，大小約1.76 kb，主要編碼復(fù)制酶(Replicase,Rep)和衣殼蛋白(Capsid,Cap)[13-14]。根據(jù)Cap基因序列的遺傳進(jìn)化分析顯示，PCV2可以分為5個(gè)基因型(Genotype)：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[14-15]。我國豬群中PCV2的感染較為普遍，因此有必要進(jìn)行豬群中PCV2的流行監(jiān)測，以便采取針對性的防控措施。

豬口腔液作為一種經(jīng)濟(jì)高效的生物檢測材料，在豬群PCV2感染監(jiān)測中的應(yīng)用效果尚不確定。為此，比較口腔液和血清在監(jiān)測豬場PCV2感染中的應(yīng)用，并進(jìn)一步分析供試養(yǎng)殖場流行的PCV2毒株的遺傳特點(diǎn)，從而為利用口腔液開展PCV2的臨床監(jiān)測提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 口腔液及血清樣品采集與處理

2019年1月，選取豫北地區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)殖場商品豬群，選擇7、9、12、15、18、21、24周齡豬群共約2 800頭豬只進(jìn)行樣品采集，每個(gè)階段選擇1棟豬群(約400頭/棟)，每棟選擇4個(gè)欄位(約20頭/欄)進(jìn)行口腔液采集，口腔液采集方法參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行；同時(shí)在4個(gè)欄位中共隨機(jī)選擇10頭豬前腔靜脈采血；共采集28份口腔液樣品和70份血液樣品，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，12 000 r/min離心2 min，將上清轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中；血液 3 000 r/min離心5 min，分離血清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 核酸提取及PCR檢測

樣品核酸提取試劑盒(EZ1 Advanced XL DSP Virus Card)購自凱杰(QIAGEN)公司，所用樣品均使用QIAGEN EZ1 AdvancedXL全自動(dòng)快速核酸提取儀進(jìn)行病毒核酸的提取。DNA聚合酶(TaqPlus MasterMix,PrimeSTAR Max DNA Polymerase)購自寶生物工程(大連)有限公司。具體的操作參照產(chǎn)品使用說明書進(jìn)行，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：2×TaqPlus MasterMix或者PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL，cDNA模板2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)參數(shù)：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s或者30 s，72 ℃延伸，延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增片段大小進(jìn)行設(shè)定，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.3 引物合成

引物序列的選擇參照已發(fā)表文獻(xiàn)[16-17](表1)，所有引物均由生工生物(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息Tab.1 Sequence information of primers

1.4 基因克隆與測序

使用高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物利用膠回收試劑盒(Omega 公司)進(jìn)行切膠回收純化，獲得的基因片段連接到pEASY-blunt載體上(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)化Trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，利用菌落PCR鑒定陽性克隆，分別挑取3個(gè)陽性克隆送生工生物(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.5 同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

主要應(yīng)用DNAStar軟件中MegAlign(Clustal W method)程序進(jìn)行核苷酸同源性分析?；贑ap基因序列，使用MEGA 6.0軟件(Neighbor-joining方法)來進(jìn)行分子進(jìn)化樹的構(gòu)建。參考毒株序列信息從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，具體的序列信息見表2。

表2 研究所用PCV2毒株序列信息Tab.2 The PCV2 sequences information in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2檢測結(jié)果

從采樣率(樣品所能代表的豬群頭數(shù)/豬群總頭數(shù))(表3)來看，28份口腔液樣品采自560頭豬只，總體采樣率約為20.0%(560/2 800)；而70份血清樣品采自70頭豬只，總體采樣率僅為2.5%(70/2 800)(表3)。從檢測結(jié)果(表4)來看，在28份口腔液樣品中，PCV2的檢出率為100% (28/28)；而在70份血清樣品中，PCV2的總體檢出率僅為2.86%(2/70)，主要對應(yīng)18周齡(10.00%)和21周齡(10.00%)的豬群階段。

表3 樣品信息Tab.3 The sample information

表4 PCV2檢測結(jié)果Tab.4 Detection results of PCV2

2.2 PCV2基因組同源性分析

為進(jìn)一步確定供試養(yǎng)殖場流行毒株的遺傳特征，成功測定了6條PCV2的基因組序列并上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(E15-1-2019、E15-2-2019、F18-1-2019、F18-2-2019、G21-2-2019和H24-1-2019)，分別來自15周齡、18周齡、21周齡和24周齡的豬群。6條PCV2基因組序列長度均為1 768 bp，核苷酸同源性分析顯示(圖1)，供試養(yǎng)殖場測定的6條PCV2基因組彼此之間的序列同源性為99.7%～100.0%，與代表性毒株AF055392(PCV2a)、AF055394(PCV2b)、DK1990 PMWSfree(PCV2c)、GDYX(PCV2d)和FuJian-625-2017(PCV2e)的同源性分別約為97.0%、95.4%、93.3%、94.4%和91.6%。

圖1 基于PCV2全基因組核苷酸同源性分析Fig.1 The genome-wide nucleotide identity of PCV2

2.3 PCV2分子進(jìn)化樹分析

為進(jìn)一步確定供試養(yǎng)殖場PCV2的基因型及遺傳進(jìn)化關(guān)系，從GenBank數(shù)據(jù)庫選擇了28株參考序列，構(gòu)建了基于Cap基因的分子進(jìn)化樹。如圖2所示，供試養(yǎng)殖場PCV2毒株具有緊密的遺傳關(guān)系，并且和PCV2a毒株處于同一進(jìn)化分支，提示供試養(yǎng)殖場流行的毒株屬于PCV2a，這與全基因組同源性分析的結(jié)果相一致。

●表示本研究測定的PCV2的基因序列；▲表示PCV2各基因型選取的代表性毒株 The black circles (●) indicat the PCV2 gene sequence in this study.The black triangles (▲) show the representative strains for each genotype

3 結(jié)論與討論

近年來，豬口腔液在豬群疫病診斷和健康監(jiān)測中應(yīng)用愈來愈廣泛。特別是非洲豬瘟(ASFV)在我國暴發(fā)以來，需要檢測、監(jiān)測的樣品數(shù)量非常大，傳統(tǒng)的血液或者組織樣品已很難滿足實(shí)際的檢測需求，口腔液因其自身的諸多優(yōu)點(diǎn)如采集便捷、經(jīng)濟(jì)高效、代表性強(qiáng)等，已經(jīng)廣泛作為非洲豬瘟的防控和精準(zhǔn)清除的常規(guī)生物檢測材料[10,18]。已有的研究更多是集中在利用口腔液開展病原學(xué)(主要是核酸)的檢測方面，如利用口腔液開展豬群中豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、圓環(huán)病毒(PCV2)和豬流感病毒(SIV)的檢測[3,11,19-20]；GRAU等[2]研究發(fā)現(xiàn)，ASFV在感染豬只3 d后可以在口腔液中檢測到病毒核酸，比出現(xiàn)臨床癥狀提前2～3 d；而口蹄疫病毒在感染后1 d即可在口腔液中檢測到；PANYASING等[1]在比較了口腔液和血清中PRV的核酸檢測結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，口腔液在檢測PRV核酸時(shí)與血清相比，具有明顯的優(yōu)勢。而口腔液能否替代血清進(jìn)行抗體檢測目前尚不清楚，且已有的結(jié)果顯示與血清相比，口腔液并沒有很明顯的優(yōu)勢，二者在相關(guān)性方面不同的研究也呈現(xiàn)出不一致的結(jié)果[11]，這可能與當(dāng)前常用的試劑盒產(chǎn)品均是基于血清學(xué)檢測進(jìn)行研發(fā)的有關(guān)。

本研究主要比較了口腔液和血清在監(jiān)測豬群中PCV2感染的應(yīng)用。結(jié)果顯示，與血清樣品相比，從采樣率來看，口腔液作為生物檢材的采樣量更少，卻能代表更廣泛的豬群；從檢測結(jié)果來看，針對群體的口腔液樣品中PCV2的檢出率非常高，而針對個(gè)體的血清樣品中PCV2的檢出率卻很低，說明在PCV2的臨床監(jiān)測中，口腔液是更合適的生物檢測材料。PCV2在流行過程中，也在不斷發(fā)生遺傳變異，如從2007年開始，PCV2b逐漸取代PCV2a成為田間的優(yōu)勢流行毒株[21]；從2012年左右開始，PCV2d又逐步有取代PCV2b成為優(yōu)勢毒株的趨勢[22]。最近又報(bào)道了一種新的基因型PCV2e的出現(xiàn)和流行[23]?；诖耍狙芯客ㄟ^序列同源性和分子進(jìn)化樹分析，進(jìn)一步確定了供試養(yǎng)殖場流行的毒株屬于PCV2a，屬于我國豬群中早期流行的基因型，PCV2a基因型的毒株在當(dāng)前的臨床檢出率是很低的，且致病性相對較弱。這也與臨床觀察到的該場豬群良好的健康狀況相一致，可能與高水平的飼養(yǎng)管理和良好的豬舍條件具有一定的關(guān)系。

本研究為利用口腔液開展PCV2感染流行的監(jiān)測提供了技術(shù)參考，同時(shí)也提示在PCV2的臨床監(jiān)測中，有必要開展進(jìn)一步的流行毒株基因型分析，以便采取針對性的防控策略。