廉小芳，李昱瑩，張婉青，郭麗麗，張有福，侯小改

(1.河南科技大學 農(nóng)學院/牡丹學院，河南 洛陽 471023； 2.河南省油用牡丹工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

油用牡丹鳳丹(Paeoniaostii‘Fengdan’)具有良好的觀賞、食用及藥用價值，因其籽油品質(zhì)高且具有很強的生態(tài)適應(yīng)性而被廣泛種植[1-2]。作為我國新興木本油料作物，油用牡丹鳳丹繁殖技術(shù)的研究具有極高的經(jīng)濟以及生態(tài)價值。目前針對牡丹的傳統(tǒng)繁殖技術(shù)較為成熟，但傳統(tǒng)技術(shù)繁殖效率低、生長周期長且受自然條件限制，難以滿足鳳丹牡丹產(chǎn)業(yè)化的市場需求[3-4]，因此加強組織培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)的研究將有利于鳳丹牡丹高效繁殖及育種工作的推進。

目前，國內(nèi)外針對牡丹組織培養(yǎng)已有一定研究成果。外植體種類繁多，主要有鱗芽、土芽、葉片、葉柄、花藥等，其中以牡丹鱗芽為外植體進行培養(yǎng)的研究報道居多[5-8]，但鱗芽適宜取材時間較短，花藥、雄蕊、花絲等更是受取材時間所限，而以葉片、土芽等為外植體進行離體培養(yǎng)存在褐化率高、污染率高和易玻璃化等現(xiàn)象。以種胚為外植體進行離體培養(yǎng)可有效避免上述問題，且對提高種子萌發(fā)率、進行雜種胚挽救和提高育種效率均具有重要意義[9]。有研究表明，內(nèi)部種胚器官分化完成的胚珠才可成功完成離體培養(yǎng)，早期胚珠則不行[10]。因此以鳳丹牡丹成熟種胚建立胚培養(yǎng)體系可保障培養(yǎng)效率，為建立再生體系的研究提供充足可靠的無菌試材，同時有效提高鳳丹牡丹組培技術(shù)在實踐生產(chǎn)中的應(yīng)用效率。

DNA甲基化是重要的表觀遺傳現(xiàn)象之一，在植物環(huán)境適應(yīng)、生長發(fā)育、基因組進化等方面具有重要的作用[11]。在植物的正常生長過程中，DNA甲基化水平與模式的改變會對植物的器官發(fā)育、物質(zhì)代謝、植株形態(tài)等產(chǎn)生重要影響[12]。植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)材料DNA甲基化模式會連續(xù)發(fā)生不同程度的變化，這表明在組織培養(yǎng)過程中遺傳物質(zhì)發(fā)生了不同程度的表觀遺傳重編程現(xiàn)象[13]。植物組織培養(yǎng)過程會出現(xiàn)少量畸形苗，而關(guān)于組培畸形苗的發(fā)生及成因的研究尚不多見[14-15]，對組培苗DNA甲基化變異的研究也鮮見報道[16-17]。因此，在建立鳳丹牡丹胚培養(yǎng)體系的同時，運用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)(MSAP)對相同培養(yǎng)條件下正常組培苗與畸形組培苗進行甲基化研究，分析不同發(fā)育形態(tài)組培材料甲基化水平及模式變異，為進一步探索鳳丹牡丹最優(yōu)無菌體系的建立提供理論依據(jù)，同時為鳳丹牡丹組培苗表觀遺傳分析鑒定提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)試驗材料

建立鳳丹牡丹胚培養(yǎng)體系所用試驗材料為當年新采收鳳丹牡丹成熟種胚。供試種子采自河南科技大學牡丹試驗基地樹齡9 a的健壯母株。挑選顆粒飽滿、種皮色澤明亮無破裂的健康成熟種子剝?nèi)》N胚進行離體培養(yǎng)。

組培室光照強度為2 000～3 000 lx(冷光燈)，光照周期為16 h/d(6:30—22:30)，室內(nèi)溫度為(25±1)℃。

1.2 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)體系的建立

1.2.1 不同光照及溫度培養(yǎng)條件處理 試驗共設(shè)置6個處理(表1)，研究鳳丹牡丹胚培養(yǎng)中不同光照及溫度條件對成苗率的影響。各處理以改良MS培養(yǎng)基(Ca2+加倍)為基本培養(yǎng)基(1.2.2同)。重復3次，每個重復10瓶，每瓶接種3個成熟種胚(1.2.2、1.2.3、1.2.4同)。

表1 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)溫度及光照培養(yǎng)條件Tab.1 P.ostii ‘Fengdan’ embryo culture temperature and light culture conditions

1.2.2 不同大小鳳丹牡丹成熟種胚處理 研究不同大小成熟種胚(<3 mm、3～4 mm、>4 mm)對污染率、存活率及成苗率的影響。培養(yǎng)光照條件為暗培養(yǎng)7 d后光照培養(yǎng)，溫度為(25±1)℃(1.2.3和1.2.4同)。

1.2.3 不同配比植物生長調(diào)節(jié)劑處理 以改良MS培養(yǎng)基(Ca2+加倍)為基本培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)劑種類及其質(zhì)量濃度配比如表2所示，共設(shè)置20個處理，研究鳳丹牡丹胚培養(yǎng)中不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對污染率、存活率及成苗率的影響。

表2 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比Tab.2 P.ostii ‘Fengdan’ embryo culture with different plant growth regulators mg/L

1.2.4 不同質(zhì)量濃度外源添加物處理 以改良MS培養(yǎng)基(Ca2+加倍)加0.8 mg/L NAA、1.0 mg/L 6-BA為培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度外源添加物，試驗共計21個處理，分別為添加馬鈴薯(A1—A5)：0、50、75、100、150 g/L，添加香蕉(B1—B5)：0、50、75、100、150 g/L，添加鳳丹牡丹胚乳(C1—C5)：0、50、75、100、150 g/L，添加椰汁(D1—D5)：0、50、75、100、150 mL/L，添加活性炭(E1—E5)：0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L。研究鳳丹牡丹胚培養(yǎng)中不同外源添加物對存活率與成苗率的影響。

1.3 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)畸形苗甲基化分析

1.3.1 DNA提取及純化 以相同培養(yǎng)條件下初代培養(yǎng)正常組培苗與畸形組培苗(圖1)為材料，使用改良版CTAB法提取基因組DNA。純化后的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。用Nano Photometer(IMPLEN，德國)分光光度計檢測DNA樣品純度及濃度。其中畸形組培苗判斷標準為：畸形苗兩子葉間不長真葉，反而從子葉邊緣或背面長出觸手狀組織，該組織不再發(fā)育成苗，最終發(fā)黃枯萎。

圖1 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)正常組培苗(A)和畸形組培苗(B)Fig.1 Normal embryo culture seedling(A) and malformed embryo culture seedling(B) of P.ostii ‘Fengdan’

1.3.2 MSAP體系建立 將限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ分別與HpaⅡ、MspⅠ組合對樣品進行雙酶切，酶切完成后進行人工接頭連接反應(yīng)，建立預(yù)擴增體系及選擇性擴增體系。試驗中所用接頭及引物信息如表3所示。最后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，得到相關(guān)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，統(tǒng)計電泳條帶，對組培苗進行甲基化水平及變異分析。

表3 MSAP體系建立的接頭和引物信息Tab.3 MSAP system established adapter and primer information

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.4.1 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計 培養(yǎng)30 d后觀察組培苗生長狀況，統(tǒng)計相關(guān)指標。成苗率、污染率及存活率計算公式如下，成苗率=誘導發(fā)育成苗外植體數(shù)/存活外植體總數(shù)×100%，污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%，存活率=存活外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 17.0進行統(tǒng)計和分析，選用鄧肯法進行單因素方差分析(P<0.05)。

1.4.2 MSAP體系建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計 甲基化條帶數(shù)據(jù)采用Quantity One和Excel 2010進行統(tǒng)計和分析，統(tǒng)計顯影后的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖版，將條帶清晰顯示的記為“1”，無條帶顯示處記為“0”，記錄所有選擇性擴增引物組合的MSAP圖譜，組成二次元矩陣，統(tǒng)計DNA甲基化4種帶型，包括非甲基化(Ⅰ)、半甲基化(Ⅱ)、全甲基化(Ⅲ)、超甲基化(Ⅳ)帶型，分析甲基化水平。總擴增位點數(shù)=Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ，總甲基化位點數(shù)=Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ，總甲基化率=(Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)×100%，全甲基化率=(Ⅲ+Ⅳ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)×100%，半甲基化率=Ⅱ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)中不同光照、溫度培養(yǎng)條件對成苗率的影響

由表4可知，不同光照及溫度培養(yǎng)條件對成苗率具有顯著影響；相同培養(yǎng)溫度(25±1)℃下，T2處理成苗率最高，為60.57%，分別是T1、T3、T4處理的1.58、1.21、1.40倍，故暗培養(yǎng)7 d后光照培養(yǎng)有利于鳳丹牡丹胚發(fā)育成苗；而對比T2、T5、T6處理，同為暗培養(yǎng)7 d后光照培養(yǎng)，T5、T6處理因溫度下降成苗率顯著降低。綜上所述，最適培養(yǎng)條件為(25±1)℃下暗培養(yǎng)7 d后進行光照培養(yǎng)。

表4 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)中不同培養(yǎng)條件對成苗率的影響Tab.4 Effect of different culture conditions on the seedling rate of P.ostii ‘Fengdan’ embryo culture

2.2 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)中不同大小成熟種胚對污染率、存活率及成苗率的影響

由表5可知，不同大小成熟種胚均能發(fā)育成苗，但成苗率無顯著差異。與其他處理相比，成熟種胚長度<3 mm時，污染率最高(12.22%)，存活率最低(77.78%)，差異顯著。成熟種胚長度為3～4 mm時，

表5 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)中不同大小成熟種胚對成苗率等的影響

其污染率最低(5.56%)，存活率最高(87.78%)，與>4 mm成熟種胚培養(yǎng)效果無顯著差異。因此，鳳丹牡丹胚培養(yǎng)最佳外植體為≥3 mm的成熟種胚。

2.3 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)中不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對污染率、存活率及成苗率的影響

由表6可知，對比含NAA的Z1—Z10各處理組，污染率最高只有6.67%，含IAA的Z11—Z20各處理組，污染率最低至8.89%，說明鳳丹牡丹胚培養(yǎng)過程中添加IAA處理污染率整體高于NAA處理。Z10處理下存活率最高，為91.11%，其次是Z5(90.00%)和Z6(90.00%)處理。Z6處理組成苗率為81.42%，顯著高于其他各處理。因此，綜合3項指標，Z6處理為鳳丹牡丹胚培養(yǎng)最適生長調(diào)節(jié)劑配比，即0.8 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA。

表6 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對鳳丹牡丹胚培養(yǎng)成苗率等的影響

2.4 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)中不同質(zhì)量濃度外源添加物對存活率與成苗率的影響

由表7可知，A、B、D各處理組存活率及成苗率無顯著差異，而D組長勢最好，其中D組中最佳處理為D3，其存活率為92.22%，成苗率為85.66%；與C1相比，鳳丹牡丹胚乳的添加顯著抑制存活率及成苗率，且高濃度胚乳的添加直接導致存活率降為0，種胚無生命現(xiàn)象；與E1相比，E3處理顯著提高成苗率，但活性炭的添加對成熟種胚存活率無顯著影響。綜合分析，D3處理，即改良MS培養(yǎng)基(Ca2+加倍)+0.8 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+75 mL/L椰汁，成苗率較高，上胚軸長勢最佳；E3處理，即改良MS培養(yǎng)基(Ca2+加倍)+0.8 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 g/L活性炭，成苗率最高，下胚軸長勢最好。

表7 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)中不同質(zhì)量濃度外源添加物對存活率和成苗率的影響Tab.7 Effect of different concentrations of additives on survival and seedling rate of P.ostii ‘Fengdan’ peony embryos

圖2A為空白對照組，即基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基中鳳丹牡丹成熟種胚培養(yǎng)效果，可以看出，子葉舒展真葉纖細弱小；圖2B為Z6處理，即添加0.8 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA處理組培養(yǎng)效果，可以看出，該組試管苗苗體稍壯，葉柄葉片較細；圖2C為D3處理，即添加75 mL/L椰汁處理組培養(yǎng)效果，該組試管苗葉片厚實，苗體茁壯；圖2D為E3處理，即添加1.0 g/L活性炭處理組培養(yǎng)效果，可以看出，活性炭的添加顯著促進胚根的伸長，真葉與子葉生長相對停滯，但苗體分化完全。

A—D分別為MS空白培養(yǎng)基、最適植物生長調(diào)節(jié)劑(Z6)、最適椰汁(D3)、最適活性炭(E3)處理培養(yǎng)效果 A—D are the culture effects of MS blank medium,optimal plant growth regulator(Z6), optimal coconut milk(D3) and optimal activated carbon(E3) respectively

2.5 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)畸形苗甲基化水平分析結(jié)果

選用30對特異性引物進行篩選，最終確定使用26對引物進行畸形組培苗DNA甲基化水平分析，得到相關(guān)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(圖3)。根據(jù)顯影結(jié)果可知，泳道內(nèi)共呈現(xiàn)4種條帶類型，分別為Ⅰ 型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型，分別代表4種DNA甲基化模式，依次為非甲基化、半甲基化、全甲基化和超甲基化。

Ma:DNA marker DL20;H:HpaⅡ酶切片段，M:MspⅠ酶切片段，表9同 Ma:DNA marker DL20;H:HpaⅡdigestion fragment，M:MspⅠdigestion fragment,the same as Tab.9

由表8可知，正常組培苗中共檢測到599個擴增位點，平均每對引物擴增23.04個位點，畸形組培苗中共檢測到726個擴增位點(比正常組培苗增多21.20%)，平均每對引物擴增27.92個位點。正常組培苗和畸形組培苗DNA發(fā)生甲基化均以全甲基化為主，全甲基化率分別為59.89%和48.28%。以正常組培苗為對照，分析畸形組培苗甲基化水平變化發(fā)現(xiàn)，畸形組培苗總甲基化水平較低，僅有74.30%，較正常組培苗(85.38%)減少了11.08個百分點，且畸形組培苗全甲基化率較低(48.28%)，減少了11.61個百分點，但其半甲基化率較高(26.02%)。

表8 鳳丹牡丹正常組培苗與畸形組培苗甲基化水平Tab.8 Methylation levels of P.ostii ‘Fengdan’ normal embryo culture seedling and malformed embryo culture seedling

2.6 鳳丹牡丹組培畸形苗甲基化模式變異分析結(jié)果

由表9可知，鳳丹牡丹畸形組培苗共出現(xiàn)4類15亞類變異模式，其中DNA甲基化模式變異A類為單態(tài)型變異，3種亞類擴增位點數(shù)分別為67、49、48個，且單態(tài)型變異占總擴增位點的17.63%。多態(tài)型變異類型中，B1—B5為去甲基化變異，擴增位點數(shù)變幅為47～130個，且去甲基化變異高達46.45%，占比最多，C1—C5為超甲基化變異，其占比僅有26.67%。因此，在鳳丹牡丹畸形組培苗中DNA甲基化模式變異以去甲基化變異為主導。

續(xù)表8 鳳丹牡丹正常組培苗與畸形組培苗甲基化水平Tab.8(Continued) Methylation levels of P.ostii ‘Fengdan’ normal embryo culture seedling and malformed embryo culture seedling

表9 鳳丹牡丹組培畸形苗甲基化模式變異Tab.9 Variations in methylation patterns in P.ostii ‘Fengdan’ embryo culture seedling

3 結(jié)論與討論

3.1 鳳丹牡丹胚培養(yǎng)體系的建立

組織培養(yǎng)技術(shù)可以在很大程度上打破傳統(tǒng)牡丹育種技術(shù)固有的局限性，但現(xiàn)如今牡丹組培體系尚未成熟，多數(shù)工作仍集中在外植體選擇、培養(yǎng)基優(yōu)化、褐化及玻璃化現(xiàn)象的改善等方面[18-21]。由于以種胚為外植體可以合理避開外植體取材時間的限制，越來越多的研究學者開始致力于牡丹種胚誘導體系的建立和完善。多數(shù)研究表明，牡丹胚培養(yǎng)時已打破休眠后的種子成苗率最高[10,20]，且本試驗發(fā)現(xiàn)，胚培養(yǎng)時不同大小成熟種胚的成苗率雖無顯著差異，但≥3 mm的成熟種胚存活率顯著高于小種胚(<3 mm)，推測在前期種子預(yù)處理中較小成熟種胚在浸泡時種胚易回縮，使胚乳在相應(yīng)位置產(chǎn)生環(huán)狀縫隙從而提升了污染的可能性，進而削弱了后期接種前試劑消毒的效力從而提升了污染率，盡管如此，成熟種胚外植體還是以其低污染零褐化優(yōu)于其他外植體選用方案，因此后續(xù)試驗可優(yōu)先選擇≥3 mm的成熟種胚作為外植體，從而優(yōu)化鳳丹牡丹組培體系。楊紅超等[22]在牡丹種子胚培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，需要先進行暗培養(yǎng)，而光照條件下培養(yǎng)45 d牡丹種胚只增大不萌發(fā)，暗培養(yǎng)和先進行7 d暗培養(yǎng)再進行12 h/d光照培養(yǎng)種胚萌發(fā)率均較高，且兩者之間無明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)，接種后直接光照確實會顯著降低種胚成苗率，但不至于完全不萌發(fā)，且與前人不同的是，經(jīng)暗培養(yǎng)7 d后光照培養(yǎng)的種胚成苗率顯著高于完全暗培養(yǎng)，成苗率增加了17.23個百分點，這可能與試驗材料差異以及前人設(shè)定光照周期較短有關(guān)。安阿莉[23]研究表明，低溫預(yù)處理能夠促進紫斑牡丹種胚萌發(fā)，4 ℃低溫沙藏15 d后接種培養(yǎng)，可顯著提高萌發(fā)率。本研究結(jié)果顯示，4 ℃低溫培養(yǎng)鳳丹牡丹成熟種胚時，成苗率顯著低于正常溫度，成苗率為22.42%，猜想低溫處理的介質(zhì)會對種胚的誘導產(chǎn)生不同的效應(yīng)。

關(guān)于不同質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比對牡丹成熟種胚培養(yǎng)的影響已有大量報道，植物生長調(diào)節(jié)劑種類多為NAA、6-BA、IAA、GA3等。大量研究表明，6-BA和NAA共同作用有助于提高鳳丹牡丹種胚培養(yǎng)的成苗率[24-26]。本試驗同樣證實了該觀點，研究發(fā)現(xiàn)改良MS培養(yǎng)基(Ca2+加倍)+0.8 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA顯著提高鳳丹牡丹種胚培養(yǎng)效率，種胚成苗率高達81.42%。除了生長調(diào)節(jié)劑的配比，在植物組培過程中還會添加各種外源物質(zhì)對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分進行進一步補充。徐德林等[27]發(fā)現(xiàn)，加入適宜濃度外源添加物(香蕉、椰汁等)能不同程度上促進白及離體培養(yǎng)時各組織的生長。王英姿等[28]結(jié)果表明，除香蕉外，椰汁、土豆等其他果蔬添加物均可提高鐵皮石斛叢生芽生長率。王愛勤等[29]添加活性炭離體培養(yǎng)蘆薈發(fā)現(xiàn)，3.0 g/L的活性炭可抑制蘆薈組培苗玻璃化，且促進蘆薈苗增殖、生長和生根。本試驗發(fā)現(xiàn)，適宜質(zhì)量濃度椰汁和活性炭的添加有助于提高鳳丹牡丹成熟種胚培養(yǎng)效率，采用改良MS培養(yǎng)基(Ca2+加倍)+0.8 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+75 mL/L椰汁培養(yǎng)成熟種胚時成苗率達85.66%，該組試管苗葉片厚實，苗體茁壯；采用改良MS培養(yǎng)基(Ca2+加倍)+0.8 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 g/L活性炭時成苗率為90.46%，促進胚根伸長。另外本試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基中胚乳的添加直接阻礙鳳丹牡丹成熟種胚的生長發(fā)育，所得結(jié)果與WANG等[30]的研究結(jié)果一致。

3.2 鳳丹牡丹畸形組培苗DNA甲基化水平及模式變異

在植物生長發(fā)育過程中，體細胞遺傳變異或表觀遺傳變異現(xiàn)象的出現(xiàn)會直接導致其優(yōu)良性狀的丟失，該現(xiàn)象將嚴重影響植物自身的經(jīng)濟價值[31]。在植物組織培養(yǎng)的過程中，由于離體培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件及繼代次數(shù)等原因，體細胞無性系變異為常見現(xiàn)象，且變異率高達30%～40%[32-34]，因此對組培苗進行遺傳變異的檢測十分重要。CARNEROS等[35]研究表明，胚胎發(fā)生過程中冷胚發(fā)生環(huán)境(18 ℃)及溫暖胚胎發(fā)生環(huán)境(28 ℃)的表觀遺傳記憶會影響挪威云杉表型中的胚芽物候和芽萌發(fā)相關(guān)基因的表達。苗徐靜[36]研究草莓離體快繁技術(shù)及草莓離體材料遺傳變異時發(fā)現(xiàn)，隨繼代次數(shù)的增加，草莓組培苗甲基化率也有所變化。LI等[37]研究認為，在植物體胚發(fā)生過程中，DNA甲基化的發(fā)生能夠調(diào)控植物體胚發(fā)生相關(guān)基因WUS等的表達，進而調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)功能基因的表達。關(guān)于牡丹組織培養(yǎng)體系中離體植株遺傳變異的研究尚未見報道，本試驗選擇胚培養(yǎng)中畸形組培苗為材料，對畸形苗的表觀遺傳現(xiàn)象進行初步探索，發(fā)現(xiàn)畸形組培苗總甲基化率較低，且主要以全甲基化(48.28%)形式存在，該結(jié)果與其他高等植物組織培養(yǎng)中組培苗總甲基化率較低且全甲基化發(fā)生形式占比較多相一致[17,37-38]，同時，鳳丹牡丹畸形組培苗DNA甲基化模式變異共有四大類，主要以多態(tài)型去甲基化變異為主，說明鳳丹牡丹組培苗在無性系繁殖過程中，表觀遺傳變異的存在導致一定程度上部分基因表達發(fā)生改變。

對鳳丹牡丹畸形苗DNA甲基化的初步研究，不僅可以在表觀遺傳學角度為畸形苗的發(fā)生機制提供新的研究思路，而且有助于對鳳丹牡丹離體后的種質(zhì)資源遺傳穩(wěn)定性進行評估，為其快速繁殖及高品質(zhì)保存提供理論依據(jù)。