束秀玉

(鹽城生物工程高等職業(yè)技術學校，江蘇 鹽城 224051)

西瓜[Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum.et Nakai]屬葫蘆科一年生藤本植物，因果實營養(yǎng)豐富、甘味多汁而深受人們喜愛，素有“盛夏之王”美譽。我國是世界上西瓜種植面積最大、產量最高的國家，西瓜產業(yè)發(fā)展在提高農民收入、促進農村經濟發(fā)展中占據重要地位[1]。西瓜枯萎病，又稱死秧病、萎蔫病，是一種由西瓜?；偷募怄哏牭毒?Fusariumoxysporumf.sp.niveum)侵染導致的具有毀滅性的真菌病害，主要以土壤和種子為傳播媒介，可在西瓜生長發(fā)育的各時期進行侵染，已成為嚴重制約西瓜產業(yè)發(fā)展的主要因素之一[2]。

目前，西瓜生產中枯萎病的防治措施主要有使用高抗品種、輪作、化學農藥噴施、嫁接栽培及施用微生物肥料等[3]。選育抗病品種是防治西瓜枯萎病較為理想的一種方法，但由于病原菌易發(fā)生變異產生較多生理小種以及西瓜廣譜抗病資源缺乏，給抗病品種選育帶來較大困難[4]；輪作是防治農作物病蟲害發(fā)生的有效措施之一，但枯萎病致病菌在土壤中存活年限較長，同時，農戶生產各自為政、土地面積有限，導致輪作實施困難，在實際生產中應用不多[5]；大劑量使用化學農藥不僅易導致致病菌產生抗藥性，而且易造成生態(tài)環(huán)境污染和農產品農藥殘留，嚴重危害人類健康[6]；嫁接栽培是目前生產上防治西瓜枯萎病最有效的方法之一，但尚存在價格高和無法解決種子攜帶病原菌的問題，限制了其在生產上的應用推廣[7]；施用微生物肥料是近年來新興的農作物病害防治方法，通過改善土壤微生物群落結構和添加拮抗菌來防治土傳病害，但防治效果尚待進一步提高，仍需開發(fā)高效拮抗菌[8]。因此，如何安全、經濟、環(huán)保、高效地防治西瓜枯萎病已成為亟待解決的關鍵問題之一。

生物質炭是由農林有機廢棄物、生物殘體及畜禽糞便等生物質在無氧或限氧條件下經高溫裂解而形成的富含碳素的多孔隙固體物質[9]。生物質炭保留了原生物質的豐富孔隙結構，具有較大的比表面積和較多的含氧活性基團，吸附能力極強，在降低土壤容重、提高土壤肥力、吸附污染物及緩解連作障礙等方面具有獨特優(yōu)勢，已廣泛應用于農業(yè)、工業(yè)和環(huán)境治理等領域[10]。近年來，生物質炭在植物土傳病害防控方面的研究報道逐漸增多,已成功應用于煙草青枯病[11]、小麥根腐病[12]、辣椒疫霉[13]和黃瓜猝倒病[14]等土傳病害防治，初步展示了其在植物土傳病害防控方面的優(yōu)勢與應用潛質。然而，關于生物質炭對西瓜枯萎病的影響尚未見相關報道。因此，以西瓜品種遷麗1號為試驗材料，研究生物質炭施用量對西瓜枯萎病的影響，并從土壤微生物特性、植株保護酶和抗病相關酶活性角度對生物質炭防控枯萎病的機制進行解析，為西瓜枯萎病的安全、經濟、環(huán)保、高效防治提供參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試西瓜品種為遷麗1號，由宿遷市農業(yè)科學研究院提供；枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌西瓜?；?號生理小種，由甘肅省農業(yè)科學院植物保護研究所提供；供試生物質炭為水稻秸稈炭，購自南京勤豐秸稈科技有限公司，裂解溫度為550 ℃，具體理化性狀為pH值9.68，有機碳、全氮、全磷、全鉀含量分別為570.86、4.45、52.66、26.58 g/kg，EC值為148.69 μS/cm，灰分含量37.52%；育苗基質為蔬菜專用育苗基質，購自山東惠民大和育苗基質有限公司；栽培基質自主配制，由經高溫滅菌2 h的土∶沙∶草炭∶蛭石=3∶3∶3∶1組成。

1.2 試驗設計

試驗于2019年3月15日在鹽城生物工程高等職業(yè)技術學校試驗基地日光溫室內開始實施，采用72穴規(guī)格的穴盤進行育苗。試驗共設4個處理，即分別向配制好的栽培基質中按質量分數加入0.5%(C1)、1.0%(C2)和2.0%(C3)水稻秸稈生物質炭，以不添加生物質炭為對照(CK)，混勻備用。三葉一心期選取大小、長勢一致的西瓜幼苗進行盆栽定植，花盆規(guī)格為15 cm×20 cm，每盆栽培基質2.5 kg、定植1株，緩苗5 d。緩苗結束后，采用灌根法接種尖孢鐮刀菌，每盆注入5 mL 1×106個/mL的孢子懸浮液，每個處理40盆，3次重復，隨機區(qū)組試驗。其中，尖孢鐮刀菌西瓜?；?號生理小種孢子懸浮液的制備參照陳亮等[15]的方法進行。整個試驗期間給予正常的水肥管理和蟲害防治，不使用防治枯萎病的相關藥劑。

1.3 測定指標及方法

于接菌后第5天開始統(tǒng)計西瓜枯萎病發(fā)生情況，每隔3 d統(tǒng)計1次，共統(tǒng)計6次。按照CHU等[16]的方法，將西瓜枯萎病分為5級：植株正常生長(0級)；全株葉部萎蔫面積≤1/4(1級)；全株葉部萎蔫面積≤1/2(2級)；全株葉部萎蔫面積≤3/4(3級)；全株萎蔫死亡(4級)。計算病情指數和防治效果。

病情指數=∑(病級×該級病株數)×100/(最高級數×調查總株數)；

防治效果=(對照病情指數-處理病情指數)× 100%/對照病情指數。

于接菌后第20天測定西瓜幼苗生長指標和土壤微生物數量。采用直尺測定西瓜幼苗的株高、根長，采用游標卡尺測定莖粗，采用烘干法測定干質量；采用五點采樣法采集各處理西瓜幼苗根際土壤，采用稀釋平板法測定土壤微生物數量，細菌、真菌、放線菌培養(yǎng)基分別為牛肉膏蛋白胨、孟加拉紅、改良高氏一號，尖孢鐮刀菌西瓜?；?號生理小種培養(yǎng)基為尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基。

分別于接種后第0、5、8、11、14、17、20天取各處理西瓜幼苗倒數第3片功能葉進行生理生化指標測定。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用抑制NBT光還原比色法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈瘡木酚法測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法測定；苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性采用苯丙氨酸比色法測定；幾丁質酶(CHT)和β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活性參照FINK等[17]的方法測定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測定。

1.4 數據處理及分析

采用Excel 2007軟件進行數據計算及作圖，采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 生物質炭施用量對西瓜枯萎病的影響

如圖1所示，接種尖孢鐮刀菌后，隨著栽培時間的延長，西瓜枯萎病病情指數逐漸升高；外施生物質炭可明顯降低西瓜枯萎病病情指數，提高防治效果；生物質炭施用量越大，西瓜枯萎病病情指數越低，防治效果越好。接菌后第20天，CK病情指數達到85.52，C1、C2、C3處理西瓜枯萎病病情指數較CK分別顯著降低10.02%、10.66%、12.45%(P<0.05)；C1、C2、C3處理的防治效果分別達到48.83%、62.66%、77.25%,說明外施生物質炭可顯著提升西瓜枯萎病防治效果，以施用量為2.0%效果最佳。

2.2 生物質炭施用量對西瓜幼苗生長的影響

由表1可知，外施生物質炭可顯著促進西瓜幼苗生長，且施用量越大,西瓜幼苗生長越好。與CK相比，C1處理株高、莖粗、根長、干質量分別顯著提高10.32%、11.01%、12.96%、14.03%；C2處理株高、莖粗、根長、干質量則分別顯著提高23.60%、23.51%、36.84%、37.91%，且顯著高于C1處理；C3處理促生效果最佳，株高、莖粗、根長、干質量分別顯著提升32.60%、32.09%、58.20%、57.01%，顯著優(yōu)于C1、C2處理(P<0.05)。說明外施生物質炭對西瓜幼苗具有明顯的促生效果，有助于提高植株的綜合抗性，以施用量為2.0%效果最佳。

表1 施用生物質炭對西瓜幼苗生長的影響Tab.1 Effects of biochar application on growth of watermelon seedling

2.3 生物質炭施用量對西瓜幼苗根際土壤微生物的影響

由表2可知，外施生物質炭可顯著提升西瓜幼苗根際土壤微生物總量，改善土壤微生物群落結構，降低土壤尖孢鐮刀菌數量。隨著生物炭施用量的加大，土壤微生物總量、細菌數量及放線菌數量均逐漸升高，而真菌數量和尖孢鐮刀菌數量則逐漸降低，土壤細菌/真菌和放線菌/真菌比值逐漸升高，逐漸由“真菌型”向“細菌型”轉化。與CK相比，生物炭施用量為0.2%時，土壤微生物總量、細菌數量、放線菌數量、細菌/真菌、放線菌/真菌比值分別提升12.45%、10.07%、44.47%、39.91%、83.47%，而真菌和尖孢鐮刀菌數量分別降低21.17%和50.52%，均達到顯著差異水平(P<0.05)。說明外施生物質炭可顯著改善西瓜幼苗根際土壤微生物群落結構，降低病原菌數量，減輕西瓜枯萎病發(fā)生。

表2 施用生物質炭對西瓜幼苗根際土壤微生物數量的影響Tab.2 Effects of biochar application on quantity of soil microorganisms in watermelon

2.4 生物質炭施用量對西瓜幼苗葉片保護酶活性的影響

SOD、POD和CAT是植物體內清除活性氧的關鍵酶組分，其活性高低與植物抗逆性密切相關；苯丙氨酸解氨酶(PAL)可催化植物產生木質素和植保素等抗性物質，是決定植物抗病性強弱的主要因素之一[18]。如圖2所示，接種尖孢鐮刀菌后，隨著栽培時間的延長，西瓜幼苗葉片的保護酶活性均呈現先升高后降低的趨勢，接種后第11天最高；外施生物質炭可顯著提升西瓜幼苗的保護酶活性，提升幅度與施用量呈正相關。與CK相比，接種后第11天，C1、C2、C3處理SOD活性分別顯著提升15.11%、26.90%、44.15%(P<0.05)，POD活性分別顯著提升13.72%、27.88%、42.34%(P<0.05)，CAT活性分別顯著提升16.40%、33.67%、46.79%(P<0.05)，PAL活性分別顯著提升7.11%、12.00%、19.11%(P<0.05)。說明外施生物質炭可顯著提升西瓜幼苗葉片的保護酶活性，從而提高對西瓜枯萎病的抗性。

圖2 施用生物質炭對西瓜幼苗葉片保護酶活性的影響Fig.2 Effects of biochar application on protective enzyme activity of Watermelon seedling leaf

2.5 生物質炭施用量對西瓜幼苗葉片CHT和GLU活性的影響

CHT和GLU與植物抗病性密切相關，可破壞并抑制真菌類病原菌的生長，是植物一種重要的防衛(wèi)反應[19]。如圖3所示，接種尖孢鐮刀菌后，隨著栽培時間的延長，西瓜幼苗葉片CHT和GLU活性均呈現先升高后降低的趨勢。外施生物質炭可顯著提升西瓜幼苗的CHT和GLU活性，且施用量越大提升幅度越高；此外，外施生物質炭處理西瓜幼苗葉片CHT和GLU活性的下降時間較CK延遲3 d。接菌后第14天，外施生物質炭的西瓜幼苗CHT和GLU活性達到最大，C1、C2、C3處理的CHT活性分別較CK顯著提升9.29%、19.44%、27.77%(P<0.05)，CLU活性分別較CK顯著提升10.67%、30.45%、44.67%(P<0.05)。說明外施生物質炭可顯著提升CHT和GLU活性，從而破壞并抑制尖孢鐮刀菌生長，減輕西瓜枯萎病發(fā)生。

圖3 施用生物質炭對西瓜幼苗葉片CHT和GLU活性的影響Fig.3 Effects of biochar application on CHT and GLU enzyme activity of watermelon seedling roots

2.6 生物質炭施用量對西瓜幼苗葉片MDA含量的影響

MDA反映了細胞膜膜質過氧化程度，是衡量植物逆境氧化損傷的重要指標。如圖4所示，接種尖孢鐮刀菌后，隨著栽培時間的延長，西瓜幼苗葉片MDA含量逐漸上升；外施生物質炭可顯著降低西瓜幼苗葉片MDA含量，且施用量越高，降低幅度越大。接種后栽培初期，4個處理的MDA含量上升幅度較小，而接種后栽培后期，上升幅度明顯加大。接種后第20天，C1、C2、C3處理MDA含量較CK分別顯著降低7.65%、15.41%、19.93%。說明外施生物質炭顯著降低了西瓜幼苗的MDA含量，緩解枯萎病造成的氧化損傷。

圖4 施用生物質炭對西瓜幼苗葉片MDA含量的影響Fig.4 Effects of biochar application on MDA content of watermelon seedling roots

3 結論與討論

生物質炭是一種新型的土壤改良劑，可改善土壤理化性狀，提高水肥利用率。本研究發(fā)現，外施生物質炭可顯著降低西瓜枯萎病病情指數，提高防治效果，以施用量為0.2%處理效果最佳，病情指數和防治效果分別較CK降低12.45%和提升77.25%。類似結果出現在劉歡歡等[12]對小麥根腐病和王光飛等[13]對辣椒疫霉的研究中，其原因可能是，一方面，生物質炭促進植物生長，增加生物量，從而提高抗病性；另一方面，生物質炭有助于改善土壤微生物群落結構，減少病原菌數量，抑制病害發(fā)生。同時，生物質炭來源于植物和畜禽糞便，不會對環(huán)境造成污染，有助于農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，應用前景廣闊。

大量研究表明，生物質炭可顯著促進植物生長發(fā)育，提高作物產量[9-10]。本研究發(fā)現，外施生物質炭可顯著促進西瓜幼苗生長，且施用量與促進效果成正相關。施用量為0.2%時，西瓜幼苗株高、莖粗、根長和干質量分別較CK提升32.60%、32.09%、58.20%和57.01%。本結果與陳芳等[9]在水稻、李中陽等[20]在小麥和張福建等[21]在辣椒上的研究結果一致，其原因可能是，一方面，生物質炭可顯著提升土壤養(yǎng)分含量，促進植物生長；另一方面，生物質炭可顯著改善土壤理化性狀，保水保肥能力明顯提升，促進植物生長和提高作物產量。

土壤微生物群落結構失衡與植物病害發(fā)生密切相關，合理調控土壤微生物多樣性和群落結構是防控植物土傳病害的關鍵所在[11]。本研究發(fā)現，外源添加生物質炭可顯著提升土壤微生物總量，提升細菌數量和放線菌數量，降低真菌和尖孢鐮刀菌數量，土壤逐漸由“真菌型”向“細菌型”過渡。本結果與劉歡歡等[12]在小麥根腐病和王光飛等[13]在辣椒疫霉上的研究結果類似，其原因可能包括，首先，生物質炭豐富的孔隙結構和巨大的表面積為微生物生長繁殖提供了良好的棲息環(huán)境，進而促進了微生物數量的增加；其次，生物質炭可以通過改善土壤環(huán)境(如通氣性、pH值、養(yǎng)分含量等)或吸附及隔離根系自毒物質等措施來改善微生物群落組成，降低致病菌數量，增加有益菌數量，提高土壤微生物多樣性。

當病原菌侵染植物時，會啟動植物體內的保護酶防御體系，從而減輕因病原菌侵染而導致的逆境脅迫。SOD、POD和CAT是負責清除活性氧的重要酶系統(tǒng)，PAL則負責植物產生植保素等抗病性物質，CHT和GLU通過破壞并抑制真菌類病原菌的生長來提高植物抗病性[19,22-23]。張成玲等[22]研究表明，鐮刀菌侵染可導致甘薯體內產生并積累大量活性氧，造成氧化損傷，而甘薯SOD、POD和CAT相互協調，清除過量活性氧，從而減輕病害損傷；張寧等[23]研究表明，PAL是蔓枯病菌誘導甜瓜抗性產生的重要酶類，其活性提升可明顯降低甜瓜蔓枯病發(fā)生；左豫虎等[19]研究表明，CHT和GLU活性提升可明顯降低大豆根腐疫霉病。本研究中，外施生物質炭可顯著提升西瓜幼苗的SOD、POD、CAT、PAL、CHT和GLU活性，顯著降低MDA含量，減輕膜質過氧化，提高西瓜枯萎病抗性。說明外源生物質炭可誘導西瓜SOD、POD、CAT、PAL、CHT、GLU活性提升，抵御尖孢鐮刀菌侵染，提高抗病性。

綜上所述，外源生物質碳可顯著提升西瓜對枯萎病的抗性，其機制主要為改善根際土壤微生物群落組成，降低致病菌尖孢鐮刀菌數量；促進西瓜幼苗生長，增加生物量，提高抗性；通過提高抗氧化酶(SOD、POD和CAT)和抗病相關酶(PAL、CHT和GLU)活性提高西瓜幼苗抗病性。