王曉敏，王 林，王彩艷，潘兵青，周雪榮

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏設(shè)施園藝(寧夏大學(xué))技術(shù)創(chuàng)新中心，寧夏 銀川 750021；3.寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021； 4.寧夏現(xiàn)代設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021； 5.澳大利亞聯(lián)邦科工組織，澳大利亞 堪培拉 2600)

茴香(FoeniculumvulgareMill.)為傘形科1～2年生草本植物，原產(chǎn)于地中海地區(qū)，因其適應(yīng)性較強(qiáng)，有較強(qiáng)的耐鹽、耐旱性，在世界各地均有栽培[1]。隨著茴香藥用和食用價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，關(guān)于茴香的研究也逐漸增多。近年來，有關(guān)茴香的研究主要集中在外觀形態(tài)描述及其生理機(jī)制闡明等[2]方面，而有關(guān)茴香基因克隆、分子調(diào)控機(jī)制等方面的研究鮮有報(bào)道，為了挖掘耐鹽、耐旱相關(guān)基因并了解其表達(dá)與調(diào)控，提取高質(zhì)量的RNA十分必要。

提取高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建、熒光定量PCR檢測(cè)、Northem雜交等分子生物學(xué)研究的前提[3-4]。目前，常用的提取植物RNA的方法有CTAB法、CTAB-水飽和酚法、異硫酸氰胍法、Trizol法等[5]，上述方法在植物上都有成功的報(bào)道，但由于植物組織在物質(zhì)組成上存在差異、在生長過程中因生長環(huán)境脅迫積累了大量的次生代謝物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖和多酚等物質(zhì)，易與RNA共沉淀，對(duì)RNA的提取和純化有干擾作用，進(jìn)一步影響總RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量[6-7]。因此，對(duì)植物不同組織總RNA提取方法進(jìn)行比較顯得尤為重要。

目前，對(duì)于茴香不同組織總RNA提取方法的比較研究尚未見報(bào)道。鑒于此，以寧夏海原地區(qū)的茴香為材料，采用CTAB改良法、CTAB-水飽和酚法、Trizol改良法和OMEGA植物RNA提取試劑盒(簡稱試劑盒法)4種方法提取茴香根、莖、葉、花和種子的總RNA，并從RNA質(zhì)量、得率及成本等方面進(jìn)行提取方法的比較，以篩選出提取茴香不同組織總RNA的最佳方法，為后續(xù)相關(guān)基因的表達(dá)及功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝課題組收集的寧夏海原地區(qū)茴香種子，種植于寧夏大學(xué)農(nóng)科實(shí)訓(xùn)基地玻璃溫室苗缽中，常規(guī)管理，根、莖、葉組織于7片葉時(shí)采樣，花組織于花期采樣并在液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。CTAB緩沖液為本實(shí)驗(yàn)室自制。Trizol試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CTAB改良法 參照吳田等[8]的方法略有改進(jìn)，不同之處在于將第4步上清液吸于新的離心管后，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)混勻后于4 ℃、12 000 r/min離心10 min。吸上清液于新的離心管，加入1/2上清液體積的5 mol/L NaCl，搖晃混勻，再加1/2上清液體積的氯仿，振蕩混勻于4 ℃、12 000 r/min離心10 min后丟棄上清液，在超凈工作臺(tái)內(nèi)干燥10 min，溶于40 μL DEPC水中，于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 CTAB-水飽和酚法 操作依照水飽和酚(北京索萊寶科技有限公司)的說明書進(jìn)行。具體操作步驟如下：稱取0.1 g速凍的新鮮組織于研缽中充分研磨至粉末狀，研磨中不斷加入液氮，將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移至65 ℃預(yù)熱含有600 μL CTAB提取液的1.5 mL離心管中，劇烈渦旋振蕩30 s，使其混勻后于65 ℃水浴2～5 min，期間振蕩3～5次，待其稍微冷卻后加入等體積的氯仿/飽和酚渦旋振蕩1 min，混勻，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，再加入等體積的氯仿振蕩1 min使其混合均勻后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移到另一新的1.5 mL離心管中，加入1/3體積的8 mol/L LiCl，使其最終濃度為2 mol/L，4 ℃過夜沉淀。隔天再于4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min后棄上清，再用70%無水乙醇洗沉淀，在超凈工作臺(tái)內(nèi)干燥10 min，溶于40 μL DEPC水中，于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 Trizol改良法 與尹慧等[9]的方法稍有不同：將第1步離心后上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，充分混勻，12 000 r/min、4 ℃離心15 min。取上清液，再加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，充分混勻，12 000 r/min離心10 min后丟棄上清液，在超凈工作臺(tái)內(nèi)干燥10 min，溶于40 μL DEPC水中，于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 試劑盒法 操作參照植物RNA提取試劑盒(美國OMEGA公司)的說明書進(jìn)行。

1.3 總RNA質(zhì)量檢測(cè)

取2 μL RNA溶液，測(cè)定RNA濃度和純度：利用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA樣品濃度和OD值。一般情況下，純凈的RNA OD260/OD280比值約為1.8；OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0；利用公式(1)計(jì)算RNA樣品得率。

RNA樣品得率=RNA質(zhì)量濃度(μg/μL)×RNA溶液體積(μL) /樣品質(zhì)量(g)

(1)

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性：取5 μL RNA樣品，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠(每100 mL凝膠含有10 μL GelRed)點(diǎn)樣孔中，140 V恒壓電泳15 min，在凝膠成像儀下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取茴香各組織總RNA的質(zhì)量分析

高質(zhì)量RNA的OD260/OD280應(yīng)在1.8～2.0，表明不受酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)的污染，質(zhì)量好；OD260/OD230應(yīng)大于2.0，說明RNA較少受到小分子和鹽類污染[10]。經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)可得各組織RNA的濃度及純度(表1)。針對(duì)茴香根組織而言，CTAB改良法和試劑盒法測(cè)得的OD260/OD280分別為2.00和1.96，介于1.8～2.0；OD260/OD230均為2.16，大于2.0，表明上述2種方法提取根RNA的純度較好；CTAB-水飽和酚法和Trizol改良法測(cè)得的OD260/OD280分別為1.74和2.24，OD260/OD230分別為1.98和1.81，表明這2種方法的所提取的根組織RNA的純度不佳。試劑盒法提取根RNA的得率最高，為99.68 μg/g，其次為Trizol改良法和CTAB改良法，分別為90.81 μg/g和71.26 μg/g，CTAB-水飽和酚法最低。因此，試劑盒法最適宜于茴香根RNA的提取。

表1 不同方法提取茴香各組織的總RNA純度及得率分析Tab.1 Purity and yield analysis of total RNA extracted from fennel tissues by different methods

針對(duì)茴香莖組織而言，CTAB改良法和試劑盒法測(cè)得的RNA OD260/OD280在分別為1.92和1.95，OD260/OD230分別為2.04和2.12，表明這2種方法所提取的莖組織RNA的純度較好；CTAB-水飽和酚法和Trizol改良法提取的RNA OD260/OD280分別為1.78和1.86，OD260/OD230分別為2.13和1.65，表明這2種方法所提取的莖組織RNA的純度不佳，可能有一定程度的降解。4種提取方法得率最高的為試劑盒法，其次為CTAB改良法和Trizol改良法，CTAB-水飽和酚法最低。因此，試劑盒法最適宜于茴香莖組織RNA的提取。

針對(duì)茴香葉組織而言，CTAB改良法、Trizol改良法和試劑盒法測(cè)得的RNA OD260/OD280分別為1.82、1.95和1.93，OD260/OD230分別為2.12、2.11和2.05，表明這3種方法的所提取的葉組織RNA的純度較好；CTAB-水飽和酚法提取的RNA OD260/OD280為2.01，OD260/OD230為1.96，表明這種方法提取的葉組織RNA純度不佳，提取的RNA可能有一定程度的降解。4種提取方法得率最高的為試劑盒法，其次為CTAB改良法和Trizol改良法，得率最低的是CTAB-水飽和酚法。因此，CTAB改良法、試劑盒法和Trizol改良法均適宜于茴香葉片組織RNA的提取，其中，試劑盒法提取效果最好。

針對(duì)茴香花組織而言，CTAB改良法和試劑盒法提取的RNA OD260/OD280均為1.91，OD260/OD230分別為2.11和2.13，表明這2種方法的所提取的花組織RNA的純度較好；CTAB改良法、試劑盒法、CTAB-水飽和酚法提取的RNA OD260/OD280分別為1.91、1.91、1.99，OD260/OD230分別為2.11、2.13、2.22，表明這3種方法的所提取的花組織RNA的純度較好；Trizol改良法提取的RNA OD260/OD280為2.05，OD260/OD230為1.79，表明這種方法所提取的花組織RNA的純度不佳，存在一定的污染或降解。4種提取方法得率最高的為試劑盒法，其次為CTAB改良法和Trizol改良法，得率最低的是CTAB-水飽和酚法。因此，試劑盒法最適宜于茴香花組織RNA的提取。

針對(duì)茴香種子而言，CTAB改良法提取的RNA OD260/OD280為1.84，OD260/OD230為2.19，表明這種方法所提取的種子RNA純度較好；CTAB-水飽和酚法、Trizol改良法和試劑盒法提取的RNA OD260/OD280分別為1.79、1.77和1.53，OD260/OD230分別為1.88、2.08和2.23，表明這3種方法所提取的種子RNA純度不佳，得率很低。4種提取方法得率最高的為CTAB改良法，試劑盒法、Trizol改良法和CTAB-水飽和酚法的得率都很低。因此，CTAB改良法最適宜于茴香種子RNA的提取。

2.2 不同方法提取茴香各組織總RNA的完整性比較

完整性好的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，其28S與18S條帶亮度的比值約為2∶1。若發(fā)生部分降解，一方面28S會(huì)降解為18S，導(dǎo)致兩者比例的改變；另一方面28S與18S降解為更小的片段，導(dǎo)致RNA條帶拖尾。若發(fā)生徹底降解，則RNA在泳道內(nèi)呈彌散狀，無任何條帶[11-13]。茴香根總RNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖1)表明，CTAB改良法及試劑盒法提取的根組織RNA的28S與18S條帶亮度的比值約為2∶1，但試劑盒法提取的RNA的28S條帶存在彌散現(xiàn)象；而其他2種方法的比值幾乎為1，甚至小于1，表明這些RNA樣品存在部分降解。綜合來看，CTAB改良法提取茴香根的RNA的完整性最好。

1.CTAB改良法； 2.CTAB-水飽和酚法；3.Trizol改良法； 4.試劑盒法。下同1.CTAB improved method; 2.CTAB-water saturated phenol method;3.Trizol improved method; 4.The kit method.The same below

茴香莖總RNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖2)表明，試劑盒法提取的莖組織RNA的28S與18S條帶亮度的比值是2∶1；而其他3種方法的比值幾乎為1，甚至小于1，表明這些RNA樣品有部分降解或污染。綜合來看，試劑盒法提取茴香莖RNA的完整性最好。

圖2 不同方法提取茴香莖總RNA的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis result of total RNA extracted from fennel stems by different methods

茴香葉片總RNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖3)表明，CTAB改良法及試劑盒法提取的葉組織RNA的28S與18S條帶亮度的比值約為2∶1；而CTAB-水飽和酚法及Trizol改良法提取的茴香葉片RNA的28S與18S條帶亮度的比值約為1∶1，在點(diǎn)樣槽內(nèi)有基因組的熒光亮度，表明這2種方法提取的RNA中有部分DNA污染。綜合來看，CTAB改良法和試劑盒法提取茴香葉片RNA的完整性較好。

圖3 不同方法提取茴香葉總RNA的電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis result of total RNA extracted from fennel leaves by different methods

茴香花總RNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖4)表明，試劑盒法提取的花組織RNA的28S與18S條帶亮度的比值是2∶1，說明提取的RNA完整性好；CTAB改良法、CTAB-水飽和酚法提取的比值幾乎為1∶1，表明RNA樣品有部分的降解及拖尾現(xiàn)象；而Trizol改良法提取的RNA條帶在泳道內(nèi)嚴(yán)重彌散。綜合來看，試劑盒法提取茴香花RNA的完整性最好。

圖4 不同方法提取茴香花總RNA的電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis result of total RNA extracted from fennel flowers by different methods

茴香種子總RNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖5)表明，CTAB改良法提取的種子RNA的28S與18S條帶亮度的比值約為2∶1；CTAB-水飽和酚法、Trizol改良法提取的茴香種子RNA的條帶幾乎看不清且存在嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象；試劑盒法提取茴香種子的RNA泳道內(nèi)無任何條帶，表明RNA已嚴(yán)重降解。綜合來看，CTAB改良法提取茴香種子RNA的完整性最好。

圖5 不同方法提取茴香種子總RNA的電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoresis result of total RNA extracted from fennel seeds by different methods

2.3 不同方法提取茴香各組織總RNA的耗時(shí)與成本比較

通過對(duì)各方法提取茴香不同組織RNA的耗時(shí)與成本比較(表2)可知，CTAB改良法成本低廉，且能夠有效去除樣品中的蛋白質(zhì)、多糖、多酚等物質(zhì)，提取的RNA完整性好，純度高，用時(shí)約8 h。試劑盒法具有高效的提取特點(diǎn)，能夠快速地從茴香根、莖、葉、花組織中提取到RNA，但不適用于種子RNA的提取，且提取過程操作簡單、耗時(shí)較短，需6 h左右，但成本較高。綜合來看，CTAB改良法及試劑盒法最適于茴香各組織總RNA的提取。

表2 RNA提取方法的耗時(shí)與成本Tab.2 Comparison of time-consuming and cost of RNA extraction methods

3 結(jié)論與討論

獲得高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行分子克隆及基因表達(dá)研究的基礎(chǔ)。目前，已有多種植物RNA提取分離的報(bào)道[14-15]，由于各植物組織成分差異較大，為確保獲得高質(zhì)量的RNA，有必要篩選出最適宜植物各組織RNA的提取方法。

本研究通過對(duì)4種方法提取茴香不同組織總RNA的效果進(jìn)行比較，篩選出提取茴香各組織最適宜的方法。在試驗(yàn)中，對(duì)于茴香根、莖、葉和花組織，試劑盒法提取的組織RNA得率最高，質(zhì)量最好；對(duì)于根和葉組織，CTAB改良法提取的RNA純度和得率較高，質(zhì)量較好，但耗時(shí)較長，且CTAB改良法在提取樟樹、棗、劍麻、甘薯等[15-19]植物的根、莖、葉及花組織的總RNA方面已有成功報(bào)道。Trizol改良法提取的RNA濃度較高，其中，提取葉的質(zhì)量濃度高達(dá)2 587.8 ng/μL，但OD260/OD280部分值大于2.0，OD260/OD230部分值大于1.8，說明提取的RNA完整性較差，RNA存在拖尾或降解現(xiàn)象，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的彌散現(xiàn)象，也證明了這一點(diǎn)。CTAB-水飽和酚法提取的RNA質(zhì)量、得率等各方面均較低，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)電泳條帶完整性較差，混雜有較多的DNA，該方法在試驗(yàn)沉淀中出現(xiàn)了少量的白色膠狀物，推測(cè)是茴香葉片中蛋白質(zhì)及多酚等物質(zhì)與RNA未完全分離導(dǎo)致，也可能是該方法試驗(yàn)操作步驟繁多及葉片中RNase活性比較高，在RNA得率少的基礎(chǔ)上又被逐漸降解，最終導(dǎo)致無法得到高質(zhì)量的RNA；Trizol改良法和CTAB-水飽和酚法不適合提取茴香根、莖、葉、花組織的總RNA。綜合來看，試劑盒法提取茴香葉片、根、莖、花RNA的質(zhì)量最好。為茴香各組織的基因克隆、mRNA表達(dá)分析等分子生物學(xué)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，也為同類植物RNA的提取提供了一定的借鑒。

與其他4種組織相比，茴香種子富含揮發(fā)油，達(dá)31.5 mL/kg，而根、莖、葉、花的揮發(fā)油含量分別為4.9、9.3、12.0、28.8 mL/kg[20]。油料作物種子中的大量油脂、蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)的存在和易氧化的特點(diǎn)均會(huì)影響RNA的提取，普通CTAB法、Trizol法和試劑盒法提取的油菜、大豆、花生和芝麻的晚期種子RNA的效果也不理想[21]。本研究中，CTAB改良法提取茴香種子RNA的效果相對(duì)于其他3種方法最好，試劑盒法提取效果最差，可能是由于茴香種子為雙懸果，種皮較厚，且富含茴香精油及多酚等物質(zhì)，降低了種子RNA的得率和濃度?？梢姡钕惴N子的RNA提取方法有待進(jìn)一步改善和探索。