楊沛方，周志楠，敖 葉，陳 祥*

（1.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；3.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025）

黔北麻羊俗稱“麻羊”，屬短毛型皮肉兼用山羊，是貴州省優(yōu)良地方山羊品種[1]，于1993 年收錄至《貴州省畜禽品種志》，2011 年被《中國畜禽遺傳資源志-羊志》收錄，2013 年獲得國家農產品地理標志登記保護[2]。該品種羊主要分布于貴州省遵義市習水、仁懷的山區(qū)，具有耐粗飼、適應性強、生產性能優(yōu)等特點，且皮張品質優(yōu)良，羊肉鮮美，深受廣大養(yǎng)殖戶及消費者的喜愛[3]。

多胎性狀作為衡量雌性動物是否優(yōu)良的一項重要繁殖指標，受排卵率、卵泡數量和質量以及生長發(fā)育情況的影響。研究發(fā)現類固醇激素、相關調控生長因子等參與卵泡生長發(fā)育調控[4]。而類固醇激素的合成對雌性動物卵泡的生長發(fā)育、閉鎖卵泡以及卵泡的增殖、凋亡都有調控作用。類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）也稱類固醇激素靈敏調節(jié)蛋白，是膽固醇由線粒體外膜到內膜的一種轉運蛋白，在膽固醇的代謝以及類固醇激素的合成中起關鍵作用[5]。膽固醇在線粒體內細胞色素氧化酶的作用下轉化為氧化固醇，在卵巢內由卵泡膜細胞和顆粒細胞合成生殖激素[6]。研究表明，StAR不僅存在于類固醇激素生成組織（腎上腺、睪丸、卵巢），還廣泛表達于其他組織，在卵巢中表達量較高[7]?？梢?，StAR在卵巢發(fā)育及排卵過程中的作用不可或缺。此外，StAR在調節(jié)睪酮的合成過程中起重要作用，是維持正常生理功能所必須的一種重要蛋白[8]。目前StAR基因mRNA 已在豬[9]、綿羊[10]、小鼠[11-12]、鵝[13]等多種動物的卵巢、睪丸中建立組織表達圖譜，豬StAR基因也已被克隆并測序驗證[14]，但其在黔北麻羊上的研究卻鮮見報道，其對山羊產羔性狀的直接關聯性也有待進一步研究。故本研究通過qRT-PCR 技術檢測StAR基因在單、多羔黔北麻羊不同組織中的表達量，克隆出黔北麻羊StAR基因編碼序列進行生物信息學分析，為進一步探討StAR基因生物學功能以及對山羊產羔的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物選自貴州省習水縣黔北麻羊中心產區(qū)富興牧業(yè)有限公司，選取體況良好、健康無病、飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)水平及免疫程序相同的18～24 月齡單、多羔母羊，屠宰后半小時內用經高壓滅菌后的鑷子、剪刀等工具采取其下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮等組織，錫箔紙包裝標簽后放入液氮低溫保存送至實驗室，置于-80℃冰柜中備用。

1.2 主要試劑及儀器 TRIzol、qPCR Mix、膠回收試劑盒、逆轉錄試劑盒、液氮（-196℃）、氯仿、50×TAE緩沖液、異丙醇、無水乙醇、瓊脂糖、氨芐青霉素購自貴州鼎國生物有限公司；pMD-19T、DNA Marker 2000購自大連寶生物工程有限公司；T4 連接酶、LB 培養(yǎng)基粉末購自上海生物工程技術服務有限公司。紫外可見分光光度計（型號：NANODROP 2000）、37℃搖床購自美國Thermo Fisher 公司；電泳儀（DYY-2C 型）、瞬時離心機、振蕩器購自北京六一儀器廠；PCR 擴增儀（C1000 TouchTM）、CFX 96 羅氏實時熒光定量PCR 儀、凝膠成像系統（Universal Hood II）購自BIO-RAD 有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物的設計、合成 根據Genbank 數據庫收錄的山羊StAR基因（登錄號為：XM_013975437.2）序列，利用Primer-BLAST 在線軟件設計其克隆和熒光引物各1 對。在StAR基因上下游處分別添加XhoI 與KpnI酶切位點并設置相應的保護堿基，選取β-actin為內參基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。引物合成后為粉末狀易粘附管壁，以4 000 r/min離心1 min后按照相應稀釋比例（10 μmol/μL）加入滅菌后的ddH2O，稀釋后分裝保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 組織總RNA 提取及首鏈cDNA 的合成 按照Trizol 法提取組織總RNA，分光光度計測定其濃度及OD 值（OD260/OD280），鑒定滿足后續(xù)實驗的組織總RNA 通過HiFi Saript 逆轉錄試劑盒合成首鏈cDNA，逆轉錄體系20 μL：dNTP mix 4 μL、HiFi-Saript 1 μL、DTT 0.1 mol/L 2 μL、Primer mix 2 μL、5×RT Buffer 4 μL、RNA 模板 1 μL、RNase-Free water 補充至20 μL。反應條件：42℃，30 min；85℃，5 min，最后將反應產物置于-20℃冰箱保存，以備后續(xù)實驗。

1.3.3 實時熒光定量PCR 檢測StAR基因在不同組織中的表達水平 在熒光定量PCR 儀上采用SYBR Green I熒光染料的方法對單、多羔母羊不同組織進行StAR基因mRNA 表達水平的檢測。將逆轉錄所得到的單、多羔母羊不同組織（下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮）的cDNA 稀釋至等濃度（500 ng/μL）作為模板。反應體系10 μL：qRT-PCR mix 5 μL、cDNA 模板1 μL、上下游引物（100 μM）各0.5 μL、ddH2O 3 μL。反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s 并添加機器自帶的熔解曲線。每組3 個重復樣按照預先設定程序進行qRT-PCR 反應。

表1 引物信息

1.3.4 PCR 擴增黔北麻羊StAR基因CDS 區(qū) 以卵巢組織首鏈cDNA 為模板，擴增StAR基因的CDS 區(qū)，PCR 擴增體系為10 μL：2×Es Taq Master Mix 5 μL、上下游引物（100 μM）各0.75 μL、cDNA 1.5 μL、ddH2O 補充至10 μL。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性10 s，退火（58℃）50 s，72℃延伸1 min，72℃終延伸10 min，PCR 反應結束后，產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否擴增出目的條帶。

1.3.5StAR基因的克隆、轉化與驗證 經凝膠電泳檢測擴增產物為所需目的條帶，按照膠回收試劑盒對其進行膠回收，做好標記，利用分光光度計對濃度和純度檢測。將膠回收產物與pMD-19T 在金屬浴16℃連接12 h，再將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中，涂板，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑取白斑菌種至含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中37℃、200 r/min 搖晃培養(yǎng)12 h。選取渾濁菌液進行菌液PCR 反應，凝膠電泳檢測，篩選出正確目的條帶的陽性菌液送至北京擎科生物科技股份有限公司進行測序。

1.3.6 黔北麻羊StAR基因生物信息學分析 菌液測序后，應用DNA Star 軟件比對StAR基因序列并使用MegAlign 將堿基序列翻譯為氨基酸序列，選取綿羊、小鼠、大鼠、豬、雞、人、白尾鹿、一角鯨、蘇門答臘猩猩等9 個物種的StAR基因序列與黔北麻羊進行同源性比對并構建相應物種的系統發(fā)育進化樹。使用Prot Param（http://expasy.org/tools/protparam.html）分析StAR 蛋白理化性質；分別利用SOPMA（http://nps apbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automa t.pl?page=npsa_sopma.html）軟件與SWISS-mode 軟件分析、預測StAR 蛋白質二、三級結構；運用ProtScale 程序分析StAR 蛋白的疏水性；利用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測StAR氨基酸的磷酸化位點；最后利用PSORT II Prediction 在線網站（http://psort.hgc.jp/form2.html）對StAR 蛋白進行亞細胞定位分析。

1.4 統計與分析 運用Excel 2007 對熒光定量數據Cq值進行統計整理，利用相對定量法2-△△CT處理實時熒光定量PCR 數據，數據以平均數±標準差表示，采用SPSS 17.0 統計分析軟件進行處理。組內單、多羔母羊不同組織表達量的比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間單、多羔母羊不同組織表達量的比較采用配對樣本t檢驗。LSD 法進行差異顯著性的檢驗，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 黔北麻羊StAR基因的PCR 擴增 如圖1 所示，熒光引物擴增出約為161 bp 大小的片段，CDS 區(qū)引物擴增出約為858 bp 大小的片段，均與預測目的片段大小一致，且條帶較為清晰、單一，可用于后續(xù)實驗。

2.2 qRT-PCR 檢測StAR基因mRNA 在不同組織的表達水平 由圖2 可知，StAR基因在單羔母羊的下丘腦-垂體-性腺軸（卵巢、輸卵管、子宮）的表達呈現波狀形式，StAR基因在單、多羔黔北麻羊卵巢組織中表達量最高，極顯著高于其他組織，在子宮組織中的表達量最低。StAR基因在單羔黔北麻羊中的表達量依次為：卵巢＞輸卵管＞垂體＞下丘腦＞子宮，其中垂體的表達量顯著高于下丘腦，其余均呈現極顯著差異。StAR基因在多羔黔北麻羊中的表達量依次為：卵巢＞垂體＞下丘腦＞輸卵管＞子宮，在垂體中的表達量顯著高于下丘腦，但在子宮與輸卵管之間未達到顯著性差異。經組間比較可知，StAR基因在單羔黔北麻羊輸卵管中的表達量極顯著高于多羔黔北麻羊，相反在多羔黔北麻羊卵巢中的表達量卻極顯著高于單羔黔北麻羊。

2.3 黔北麻羊StAR基因T 克隆載體的鑒定 如圖3 所示，目的條帶明亮清晰、單一且位于858 bp 處。陽性菌液經測序后顯示，黔北麻羊StAR基因相比于NCBI中山羊StAR基因的CDS 區(qū)序列吻合度高達99.53%，共發(fā)生4 處突變，分別是第139、312 位堿基由C 突變?yōu)門，第160 位堿基由T 突變?yōu)镚，第315 位堿基由T突變?yōu)镃。4 處突變中有2 處為同義突變，2 處為錯義突變，同義突變沒有引起氨基酸序列的改變，錯義突變分別由第139 位與第160 位堿基的改變所引起，其中第139 位堿基的突變導致氨基酸由丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第160 位堿基的突變導致氨基酸由原始的亮氨酸突變?yōu)榫彼帷＞篜CR 及測序驗證證實StAR基因編碼序列已成功克隆至pMD-19T 載體中，pMD-19T-StAR 亞克隆載體構建成功。

2.4 黔北麻羊StAR基因的生物信息學分析

2.4.1 黔北麻羊StAR 蛋白理化性質分析 黔北麻羊StAR基因編碼區(qū)包含858 個堿基，共編碼285 個氨基酸，蛋白分子量約為31.87 ku，理論等電點為9.12，ExPASy 顯示黔北麻羊StAR 是由1 398 個C 原子、2 295 個H 原子、409 個N 原子、410 個O 原子以及15 個S 原子組成的化學式為C1398H2295N409O410S15的分子，共由4 527個原子構成，在哺乳動物體中的半衰期約為30 h。就其氨基酸組成而言，StAR基因編碼序列主要由亮氨酸、纈氨酸、谷氨酸、精氨酸組成，分別占氨基酸總數的11.9%、8.1%、8.1%、8.1%；組氨酸與苯丙氨酸的含量最少，僅有1.4%；帶正電荷的氨基酸殘基數量大于帶負電荷的殘基，證明黔北麻羊StAR 編碼的氨基酸序列帶正電。另外，StAR 蛋白的不穩(wěn)定指數為42.66（不穩(wěn)定指數＞40），可將此蛋白視為不穩(wěn)定蛋白。

2.4.2 黔北麻羊StAR 蛋白疏水性預測與分析 ProtScale分析黔北麻羊StAR 蛋白疏水性圖譜見圖4，橫坐標為StAR 編碼的氨基酸序列位置，縱坐標代表疏水性評分，以0 分為界，數值越大，疏水性越強，數值越小，親水性越強。黔北麻羊StAR 編碼的285 個氨基酸序列中，第95 位甘氨酸親水性最強，評分為-3.000，第201 位谷氨酸疏水性最強，評分為1.789。0 分以下氨基酸數量大于0 分以上，證明黔北麻羊StAR 蛋白為疏水性蛋白，ExPASy 程序分析得出StAR 蛋白親水平均值為-0.276，ProtScale 程序與ExPASy 程序對其得出的結論一致。

2.4.3 黔北麻羊StAR 蛋白質高級結構分析與預測 將克隆出的StAR 編碼的285 個氨基酸序列放入SOPMA在線分析軟件發(fā)現，黔北麻羊StAR 蛋白質二級結構主要由106 個α-螺旋、17 個β-轉角、111 個無規(guī)則卷曲與51 個延伸鏈組成（圖5），分別占比為37.19%、5.96%、38.95%、17.89%，可見黔北麻羊StAR 蛋白質二級結構主要由α-螺旋與無規(guī)則卷曲構成。進一步使用SWISS 程序預測黔北麻羊StAR 蛋白質三級結構（圖6），發(fā)現α-螺旋與無規(guī)則卷曲占據整個結構大部分，與二級結構分析結果一致。

2.4.4 黔北麻羊StAR 蛋白亞細胞定位分析 運用PSORT II Server 在線網站對黔北麻羊StAR 蛋白進行亞細胞定位分析，發(fā)現其有可能位于真核生物的線粒體、細胞質、細胞核、內質網、細胞骨架等5 種結構中，預測比例分別為47.8%、30.4%、13.0%、4.3%、4.3%，在線粒體中的可能性最大，在內質網以及細胞骨架中的可能性最小。

2.4.5 黔北麻羊StAR 磷酸化位點的預測 通過NetPhos 3.1 Server 程序分析磷酸化位點得知，黔北麻羊StAR 可能存在23 個磷酸化位點，其中包括14 個絲氨酸磷酸化位點（分別位于第12 位、第13 位、第19 位、第57 位、第61 位、第66 位、第69 位、第100 位、第150 位、第186 位、第195 位、第233 位、第261 位、第277位氨基酸）、5 個蘇氨酸磷酸化位點（分別是第5 位、第190 位、第204 位、第240 位、第263 位氨基酸）、4 個酪氨酸磷酸化位點（分別是第68 位、第75 位、第134 位、第206 位氨基酸）。

2.4.6 黔北麻羊StAR 氨基酸同源性分析以及系統進化樹的構建 選取綿羊、小鼠、大鼠、豬、雞、人、白尾鹿、一角鯨、蘇門答臘猩猩等9 個物種與黔北麻羊StAR基因編碼序列進行同源性分析，結果顯示黔北麻羊StAR編碼序列與綿羊、小鼠、大鼠、豬、雞、人、白尾鹿、一角鯨、蘇門答臘猩猩的同源性分別為98.6%、83.8%、84.5%、90.2%、68.0%、87.0%、95.1%、91.6%、87.0%（圖7），可見，黔北麻羊StAR 編碼序列在哺乳動物中具有較高的相似性，與非哺乳動物（雞）的相似性較低。同時，采用NJ 法構建的系統進化樹得出哺乳動物聚集成為一個大分支，黔北麻羊與綿羊的親緣關系最近，與雞的親緣關系最遠。黔北麻羊StAR基因編碼序列具有良好的種屬特異性，與對比的10 個物種親緣關系依次為綿羊＞白尾鹿＞一角鯨＞豬＞小鼠＞大鼠＞人＞蘇門答臘猩猩＞雞（圖8），與同源性分析結果一致。

3 討 論

類固醇激素（Steroid Hormone）的合成與分泌受機體內分泌系統、神經系統調節(jié)，在母畜繁殖過程中發(fā)揮著重要作用。StAR 是類固醇激素合成過程中具有高度特異性的調節(jié)因子，位于相關細胞的線粒體膜上，對膽固醇進入線粒體內膜合成類固醇激素的過程具有限速作用[15]。已有大量研究證實，StAR 能夠參與卵泡的生長發(fā)育，調控排卵以及成熟卵泡的運輸等多種生理過程，并能在卵巢組織中特異性表達[16-17]。苗艷平等[18]在對綿羊卵巢oar-mir-150 靶向調節(jié)類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白基因的表達研究中發(fā)現StAR基因卵泡期較黃體期表達顯著上調。但StAR基因對山羊產羔性狀相關研究尚未報道，本研究以卵巢組織cDNA 為模板，PCR擴增黔北麻羊StAR基因的CDS 區(qū)發(fā)現與山羊StAR基因序列相比共有4 處突變，其中2 處為同義突變，不引起氨基酸的改變，2 處為錯義突變，分別為丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸、亮氨酸突變?yōu)榫彼?，但比對成功率高達99.51%，氨基酸改變是否會導致基因序列以及功能的改變還有待進一步驗證。另外，黔北麻羊StAR 是一種定位在線粒體中的不穩(wěn)定疏水性蛋白，與其作用定位相符；同時黔北麻羊StAR基因編碼序列與綿羊的同源性最高，遺傳距離最近，親緣關系最好、與哺乳動物的同源性均保持在較高水平，在進化樹聚集為一個大的分支，證實黔北麻羊StAR基因編碼序列在不同哺乳動物中均具有較高的保守性，但其與雞的同源性較低、遺傳距離也相對較遠，這證實黔北麻羊StAR基因編碼序列同時具有良好的種屬特異性，符合自然遺傳進化規(guī)律。本研究還得出黔北麻羊StAR基因編碼序列存在23 個磷酸化位點，表明此基因易發(fā)生信號傳導，從而對細胞生長發(fā)育產生影響。

另外，StAR基因在單、多羔黔北麻羊母羊性腺組織中均有表達，且在卵巢中的表達量最高，與Fatemeh等[19]研究證實類固醇合成急性調節(jié)蛋白高表達于卵巢組織的結論相符。貴州大學生命科學學院前期以香豬卵巢組織為模板并采用轉錄組測序技術發(fā)現StAR基因在高產仔香豬卵巢組織中的表達極顯著高于低產仔香豬，其驗證結果與轉錄組測序趨勢相符[20]。黃龍等[21]以高、低產仔數約克夏母豬為研究對象的轉錄組測序數據也表明StAR基因高表達于高產仔約克夏母豬中，從而推測StAR基因可作為豬產仔數的候選基因。本研究結果與上述研究結果相符，卵巢作為雌性動物的重要生殖器官，對山羊產仔數起著直接調控作用，結合本研究數據提示StAR基因可能作用于卵巢并可能對山羊的產羔數量具有一定的促進作用。

4 結 論

本研究發(fā)現StAR基因在單、多羔黔北麻羊母羊的下丘腦-垂體-性腺（卵巢、輸卵管、子宮）軸中均有表達，與NCBI 中山羊StAR基因的CDS 區(qū)序列吻合度高達99.53%，共有4 處突變，編碼區(qū)包含858 個堿基，共編碼285 個氨基酸，其蛋白質二級結構主要由α-螺旋與無規(guī)則卷曲構成，該蛋白最有可能位于線粒體中。另外，通過構建系統進化樹分析認為黔北麻羊與綿羊的親緣關系最近。