劉麗杰，劉凱，孫玉婷，王璐瑤，丁美云，張東向，金忠民

(齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

重金屬是指密度在5.0 g/cm3以上的金屬元素，大約有45種元素.近年來，由于人類的生產(chǎn)和生活活動造成了重金屬對環(huán)境的污染，尤其是對土壤的污染[1-2].植物修復技術(shù)從20世紀90年代開始作為一種治理污染土壤的新技術(shù)被推廣應(yīng)用[3].植物修復技術(shù)成本低、適應(yīng)性廣、操作方便、不破壞生態(tài)環(huán)境，并且不會引起二次污染.植物修復能夠使重金屬的移動性降低，從而避免重金屬進入食物鏈[4]，因此重金屬的植物修復技術(shù)表現(xiàn)出一定的市場經(jīng)濟價值和更加廣闊的發(fā)展前景.

車前草(Plantagoasiatica)，又叫車輪菜、牛甜菜，是一種多年生草本植物.我國是車前草資源比較豐富的國家，南方和北方都有分布.車前草具重金屬富集作用，且是一種生物量大，生長速度非?？斓闹参铮虼司哂泻艽蟮臐摿Τ蔀橥寥牢廴镜男迯椭参?目前，關(guān)于車前草對重金屬的積累方面已經(jīng)有一定的研究，比如車前草對重金屬Cu、P b、Cd、Ni、Zn等的吸附，主要集中在車前草對單一金屬離子的吸附特性上[5-9]，關(guān)于車前草吸附重金屬離子(尤其是復合金屬離子)的機理以及重金屬對車前草生理代謝方面的研究還比較少.因此，本研究利用生理生化的研究方法，對重金屬Cu2+和Ni2+單一及復合污染下車前草對重金屬的積累特性及生理生化指標進行了研究，旨為探究車前草如何抵御外界逆境脅迫，同時為為植物修復土壤污染提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用車前草種子，購于齊齊哈爾市齊豐種子公司.2019年3～6月在齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院植物生理與代謝實驗室進行車前草盆栽試驗.2019年3月對車前草種子進行播種，所用土壤采自齊齊哈爾市嫩江邊，沒有經(jīng)過重金屬處理.將播種后的花盆放到適宜的光照、水分和溫度條件下，長出幼苗后待用.

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用Cu和Ni 2因素4水平交互試驗，具體處理見表1.取已經(jīng)風干并過篩的土壤1 kg，均勻混合裝入花盆(直徑為16 cm，高度為16 cm)中，按表1中的濃度梯度加入重金屬溶液，用CuSO4·5H2O和Ni (NO3)2·6H2O換算成質(zhì)量，配成500 mL溶液加入到稱好的土壤中，每個處理重復20次，以不加任何重金屬的土壤作為對照.車前草幼苗生長3周后，將長勢較一致并且狀況良好的幼苗移栽到重金屬處理后的花盆中，每盆栽3株.在車前草生長的過程中，根據(jù)土壤的水分情況適當澆水，保證植株正常生長.在2019年6月下旬收獲重金屬處理和對照的車前草植株，測定株高，并用自來水沖洗植株上的土壤，再用去離子水洗凈，擦干，備用.

1.3 測定及計算方法

在進行重金屬含量測定時，將車前草葉片和根部烘干，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法進行測定[10].測定車前草的株高、地上和地下部分鮮重.在進行生理指標測定時用鮮樣：MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法；葉綠素含量測定采用丙酮法；POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[11]；SOD活性測定采用Spycbaha的方法[12]；CAT活性測定采用過氧化氫還原法[13].

重金屬富集系數(shù)=植物體內(nèi)重金屬含量/土壤(或沉積物)中重金屬含量(栽種車前草之前的含量)×100%

轉(zhuǎn)移系數(shù)=地上部分的重金屬含量/地下部分的重金屬含量

耐性系數(shù)=植物在重金屬脅迫下的最大根長/對照條件下的最大根長

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

采用Excel 2010進行圖表制作，利用SPSS20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行數(shù)據(jù)間的差異顯著性分析.

表1 Cu2+和Ni2+的不同配比組合

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下車前草葉片和根中重金屬Cu2+、Ni2+的含量

隨著重金屬Cu2+濃度的增加，車前草幼苗根中重金屬Cu2+含量呈先升高后下降趨勢(圖1).Cu-Ni復合處理時，促進了根中Cu2+含量的增加.與對照相比，處理7、處理10、處理11、處理14和處理15根中Cu2+含量顯著增加(P<0.05)；葉中重金屬 Cu2+含量明顯低于根，單獨Cu2+處理以及Cu-Ni復合處理后的變化趨勢與根相同，隨著重金屬Ni2+濃度的增加，車前草根中Ni2+含量逐漸增加，低濃度Cu2+處理對Ni2+含量的影響不大，當Cu2+濃度達到700 mg/kg以后，Ni2+含量隨之增加，與對照相比，處理7、處理10、處理11、處理14和處理15的Ni2+含量顯著增加(P<0.05)；車前草葉片中Ni2+含量顯著低于根中的含量(P<0.05)，并且隨著Cu2+和Ni2+含量的增加呈現(xiàn)上升趨勢，處理15 Ni2+含量達到最大值，為540 mg/kg(圖2).

同種器官的不同字母代表差異顯著(P<0.05).Different letters of the same organs represent significant differences(P<0.05).圖1 不同重金屬處理后車前草葉片和根中Cu2+含量分布Figure 1 Distribution of Cu2+ contents in the leaves and roots of Plantago asiatica under different heavy metals treatments

不同器官的不同字母代表差異顯著(P<0.05)Different letters of the same organs represent significant differences(P<0.05).圖2 不同重金屬處理后車前草葉片和根中Ni2+含量分布Figure 2 Distribution of Ni2+ contents in the leaves and roots of Plantago asiatica under different heavy metal treatments

2.2 不同處理下車前草對Cu2+和Ni2+的富集系數(shù)、轉(zhuǎn)移系數(shù)和耐性系數(shù)變化

富集系數(shù)指植物中某種重金屬的含量與灌溉溶液中該種重金屬含量的比值.隨著重金屬 Cu2+濃度的增加，車前草對Cu2+的富集系數(shù)呈現(xiàn)整體下降的趨勢；Cu-Ni復合處理下，富集系數(shù)先上升后下降，除了處理1(Cu2+為200 mg/kg，Ni2+為100 mg/kg)外，其他處理與對照相比差異顯著(P<0.05)(圖3).隨著Ni2+濃度的增加，車前草對Ni2+的富集系數(shù)也呈現(xiàn)整體下降的趨勢；Cu-Ni復合處理后促進了富集系數(shù)的下降.與對照相比，只有處理7差異顯著(P<0.05).

同種重金屬不同字母代表差異顯著(P<0.05).Different letters of the same metal represent significant differences(P<0.05).圖3 車前草對銅和鎳的富集系數(shù)變化Figure 3 Changes of enrichment coefficient of Cu2+ and Ni2+ of Plantago asiatica

轉(zhuǎn)移系數(shù)指植物地上部分重金屬濃度與根中該種重金屬濃度的比值.在本研究中車前草的Cu2+轉(zhuǎn)移系數(shù)逐漸降低，但變化不顯著(圖4).Cu-Ni復合處理使轉(zhuǎn)移系數(shù)下降更快，但只有處理7、處理11、處理14和處理15( Cu2+為1200 mg/kg，Ni2+為200 mg/kg)下降達到顯著水平(P<0.05)；隨著重金屬Ni2+濃度的增加，車前草的Ni2+轉(zhuǎn)移系數(shù)表現(xiàn)出上升的趨勢，Cu-Ni復合處理促進了轉(zhuǎn)移系數(shù)的升高.除了處理1、處理2、處理4和處理5與對照相比差異不顯著外，其余處理均顯著高于對照(P<0.05).

同種重金屬不同字母代表差異顯著(P<0.05).Different letters of the same metal represent significant differences(P<0.05).圖4 車前草對銅和鎳的轉(zhuǎn)移系數(shù)變化Figure 4 Changes of transfer coefficient of Plantago asiatica of Cu2+ and Ni2+

耐性系數(shù)可用來評價植物對重金屬的耐性，指植物在重金屬脅迫下的最大根長與對照條件下的最

圖5 車前草對銅和鎳的耐性系數(shù)變化Figure 5 Changes of tolerance coefficient of Plantago asiatica to Cu2+ and Ni2+

大根長的比值.由圖5可知，Cu2+的增加對車前草耐性系數(shù)的變化影響較小，但隨著Ni2+的增加，車前草的耐性系數(shù)則呈現(xiàn)先升后降的趨勢，除了處理1以外，均顯著高于對照(P<0.05)，處理10(Cu2+為700 mg/kg，Ni2+為150 mg/kg)達到最大值1.4.

2.3 不同濃度重金屬處理下車前草生長特性指標的變化

重金屬Cu 和Ni單一和復合處理都使車前草的株高降低，單獨Ni處理時與對照差異不顯著，單獨Cu處理以及復合處理組的株高都顯著低于對照(P<0.05)(圖6).

圖6 不同重金屬處理下車前草株高變化Figure 6 Plant height changes of Plantago asiatica under different heavy metal treatments

重金屬Cu 和Ni單一和復合處理都使車前草的地上部分和地下部分生物量減少.單獨Cu處理時，Cu2+濃度達到700 mg/kg以上時，生物量顯著低于對照(P<0.05)；單獨Ni處理時，Ni2+濃度達到200 mg/kg，生物量顯著低于對照(P<0.05)；Cu-Ni復合處理后，除了處理5和處理6以外，其他處理的生物量均顯著低于對照(P<0.05)(圖7).

圖7 不同重金屬處理下車前草生物量變化Figure 7 Biomass changes of Plantago asiatica under different heavy metal treatments

2.4 不同重金屬處理下車前草葉片MDA含量的變化

由圖8可知，單獨Cu2+處理時，MDA含量都顯著高于對照(P<0.05)；單獨Ni2+處理時，MDA含量葉都高于對照，但差異都不顯著；兩種重金屬復合處理時，MDA含量都顯著高于對照(P<0.05).

圖8 車前草MDA含量變化Figure 8 Changes of MDA content of Plantago asiatica

2.5 不同重金屬處理下車前草葉片葉綠素含量的變化

由圖9可知，單獨重金屬Cu2+和Ni2+的濃度增加使車前草葉片葉綠素含量先增加后下降，單獨重金屬Cu2+處理時，低濃度Cu2+處理時增加不顯著，但當重金屬Cu2+達到700 mg/kg(處理8)時,葉綠素含量顯著下降(P<0.05)，與對照相比下降20%；單獨重金屬Ni2+處理時，葉綠素含量先增加后下降，在Ni2+濃度為200 mg/kg時,葉綠素顯著低于對照(P<0.05)；兩種重金屬復合處理時，處理5、處理6、處理10葉綠素含量高于對照，處理7、處理9、處理11、處理13和處理15均顯著低于對照(P<0.05).

圖9 車前草葉綠素含量變化Figure 9 Changes of chlorophyll content of Plantago asiatica

2.6 不同重金屬處理下車前草葉片抗氧化酶活性的變化

由圖10可知：單獨重金屬Cu2+處理使SOD活性增強，但差異沒有達到顯著水平；而單獨Ni2+處理也使SOD活性增加，但僅在Ni2+濃度達到200 mg/kg(處理3)時差異達到顯著水平(P<0.05)，此時SOD活性為對照的1.38倍；兩種重金屬復合處理時，SOD活性均顯著高于對照，處理15(Cu2+濃度為1 200 mg/kg，Ni2+濃度為200 mg/kg)達到最高值，為對照的1.77倍.

圖10 車前草SOD活性變化Figure 10 Changes of SOD activity of Plantago asiatica

由圖11可知：單獨重金屬Cu2+處理和單獨Ni2+處理都使POD活性增強，但差異均沒有達到顯著水平；兩種重金屬復合處理時，POD活性都高于對照，除了處理5(Cu2+濃度為200 mg/kg，Ni2+濃度為100 mg/kg)和處理6(Cu2+濃度為200 mg/kg，Ni2+濃度為150 mg/kg)，其他處理均與對照差異顯著，處理15(Cu2+濃度為1 200 mg/kg，Ni2+濃度為200 mg/kg)達到最高值，為對照的2.15倍.

圖11 車前草POD活性變化Figure 11 Changes of POD activity of Plantago asiatica

由圖12可知，重金屬Cu2+和Ni2+單獨及復合處理都使CAT活性增強，僅在處理1(Cu2+濃度為0 mg/kg，Ni2+濃度為100 mg/kg)、處理4 (Cu2+濃度為200 mg/kg，Ni2+濃度為0 mg/kg)和處理5(Cu2+濃度為200 mg/kg，Ni2+濃度為100 mg/kg)時，與對照相比差異不顯著，其他處理均顯著高于對照，并且兩種重金屬復合處理時，CAT的活性高于Cu2+和Ni2+單獨處理，在Cu2+和Ni2+均達到最高值時(處理15)，CAT活性也達到最高值，為對照的4.1倍.

圖12 車前草CAT活性變化Figure 12 Changes of CAT activity of Plantago asiatica

3 討論

3.1 車前草對Cu2+和Ni2+的積累及富集特征

重金屬銅(Cu)和鎳(Ni)是植物生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)元素，很容易被植物吸收，但是過量的銅和鎳會使植物受到毒害[14-15].在本研究中， 一定濃度的Cu2+和Ni2+處理后，車前草仍然能夠正常生長，說明車前草對銅和鎳都具有非常強的抗性.隨著重金屬Cu2+和Ni2+濃度的增加，車前草的地上部分和地下部分Cu2+和Ni2+含量也逐漸增加，地下部分Cu2+和Ni2+含量顯著高于地上部分，說明車前草根部積累了大部分重金屬Cu2+和Ni2+，少量轉(zhuǎn)移到地上部分，地下部分根作為植物吸收土壤中Cu2+和Ni2+的第一個器官，對植物抵抗外界環(huán)境Cu2+和Ni2+毒害起到非常重要的作用，這與陸引罡等[16]的研究結(jié)果一致.銅和鎳復合處理促進了車前草對Cu2+和Ni2+的吸收,使車前草地上部分和地下部分Cu2+和Ni2+的含量都有所增加，說明Cu-Ni復合污染對車前草富集Cu和Ni可能有協(xié)同作用，這與車前草在Cd-Pb復合污染時對其富集Cd有協(xié)同作用的研究結(jié)果相似[17].

車前草對重金屬Cu2+的轉(zhuǎn)移系數(shù)隨著重金屬Cu2+濃度的增加而逐漸減小，說明土壤中 Cu2+濃度的增加對車前草Cu2+從地下部分向地上部運輸有一定的抑制作用，這與楊櫻[18]在車前草對重金屬銅的富集方面的的研究結(jié)果基本一致，并且低濃度重金屬Ni2+可抑制Cu2+向地上轉(zhuǎn)運，但隨著Ni2+濃度的增加，車前草對重金屬Cu2+的轉(zhuǎn)移系數(shù)也逐漸增加，可見Cu-Ni復合污染對Cu2+向地上部分轉(zhuǎn)移具有一定的協(xié)同作用；車前草對重金屬Ni2+的轉(zhuǎn)移系數(shù)隨著重金屬Ni2+的增加而逐漸增加，土壤中Ni2+濃度的增加對車前草Ni2+從地下部分向地上部運輸有一定的促進作用，這與高凌顏等[19]對旱傘草銅富集及吸收的研究結(jié)果相似,當銅和鎳復合處理時，Cu2+濃度的增加可促進Ni2+轉(zhuǎn)移到地上部分，即Cu-Ni復合污染對Ni2+向地上部分轉(zhuǎn)移也具有一定的協(xié)同作用.

富集系數(shù)是反映植物對重金屬離子富集能力大小的指標，當植物對某種重金屬的富集系數(shù)大于1時，便可認定該種植物對此種重金屬具有富集能力，富集系數(shù)越大說明植物對該金屬的吸收能力越強，一般來說，富集系數(shù)大于10的植物可認定為對某種重金屬超富集植物[20].在本研究中Cu2+的富集系數(shù)隨著重金屬Cu2+濃度的提高而逐漸降低，對照組和處理4(Cu2+濃度為200 mg/kg、Ni2+濃度為0)和處理8(Cu2+濃度為700 mg/kg、Ni2+濃度為0)時，車前草對Cu2+的富集系數(shù)都大于1，說明車前草是銅富集植物，但沒有達到超富集的水平，但Cu-Ni復合處理降低了車前草對Cu2+的富集；車前草對Ni2+的富集系數(shù)也隨著重金屬濃度的提高而逐漸下降，在低濃度Ni2+處理時，車前草對Ni2+的富集系數(shù)>1,說明車前草也是鎳富集植物，這與魏芳雪等[21]對車前草的研究結(jié)果基本一致，并且Cu-Ni復合處理使車前草對Ni2+的富集系數(shù)進一步下降，當Cu2+濃度達到最高值時有所升高，但變化幅度很小.

3.2 車前草對Cu2+和Ni2+處理的生理響應(yīng)

重金屬處理后，車前草的株高降低，生物量減少，當重金屬濃度達到其閾值后生物量顯著降低，說明此時重金屬濃度已經(jīng)影響到車前草的正常生長，已達到車前草吸附重金屬的極限.植物在正常情況下，其體內(nèi)的各項生理代謝過程都是協(xié)調(diào)且穩(wěn)定的，一旦植物遇到逆境脅迫時，其體內(nèi)的各種代謝活動會受到影響而失去平衡，這時植物會對逆境作出反應(yīng)，細胞膜系統(tǒng)會受到一定的損傷，膜脂會發(fā)生過氧化，而產(chǎn)生MDA，MDA含量的多少可以反應(yīng)逆境下植物受傷害的程度，MDA的含量越高，植物細胞膜受到的傷害就越嚴重[22].當車前草受到重金屬Cu2+和Ni2+毒害后，細胞膜的透性增加，膜系統(tǒng)受到損害，MDA的含量增加，這與胡雪華等[23]在鋁脅迫對車前草影響的研究結(jié)果基本一致.尤其是當兩種重金屬同時處理時，MDA含量增加的幅度更大，當兩種重金屬都達到最高濃度時，MDA含量達到峰值，是對照的4倍.但在低濃度重金屬Cu2+和Ni2+處理時，MDA含量增加的幅度較小，這可能是車前草對重金屬 Cu2+和Ni2+具有一定抗性的重要原因之一.

當植物遭受逆境脅迫時，細胞內(nèi)會積累大量的活性氧，使其代謝失去平衡，最終造成細胞膜系統(tǒng)發(fā)生嚴重的氧化損傷[24-25].逆境脅迫會使植物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)活性增強，從而防止細胞內(nèi)過量積累的活性氧對植物造成的氧化傷害.保護酶體系 SOD、POD和CAT能夠?qū)^氧化物起到一定的清除作用，從而防止自由基對植物的毒害.在本試驗中，在一定的范圍內(nèi)SOD、POD和CAT 3種酶的活性都隨著 Cu2+和Ni2+濃度的增加而呈現(xiàn)出上升的趨勢，這個趨勢與焦軼男等[26]的研究結(jié)果并不完全一致，他們的結(jié)果是先上升后下降.Cu-Ni復合處理使兩種保護酶活性上升的幅度增大，說明Cu2+和Ni2+可能導致了細胞內(nèi)外過氧化物的累積，此時，車前草體內(nèi)的保護酶體系便會啟動，對脅迫作出相應(yīng)的反應(yīng)，從而對車前草有機體進行保護.兩種重金屬復合處理時，保護酶的反應(yīng)更加迅速而有效，在保護酶活性的變化中都表現(xiàn)出上升的趨勢，這種上升趨勢一直在增加，說明沒有超過 SOD、POD和CAT的忍受范圍，它們的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)還沒有受到較大的破壞.

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，車前草可以在一定濃度的重金屬Cu2+和Ni2+處理下積累銅和鎳(單獨Cu2+700 mg/kg以內(nèi)、Ni2+200 mg/kg以內(nèi)，以及Cu2+200 mg/kg、Ni2+100 mg/kg；Cu2+200 mg/kg、Ni2+150 mg/kg范圍內(nèi)的Cu-Ni復合處理)，存在明顯的生理適應(yīng)，具有一定的修復潛能.但本試驗僅從車前草對重金屬銅和鎳的積累量、富集特征、生理響應(yīng)幾方面分析了車前草對銅和鎳單獨及復合污染修復的機理，更加深入的毒害機理，如車前草的根系微生物是否和植物共同作用等，還有待于從分子及細胞水平進一步研究.