李恩琛，張樹武，徐秉良，劉佳，吉寶麗，唐仕娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

中國是蘋果生產(chǎn)第一大國，年產(chǎn)量穩(wěn)居世界第一[1].截止2017年，我國蘋果栽培面積達232.38萬hm2，栽培規(guī)模世界第一[2].由于蘋果病害的不斷發(fā)生，尤其蘋果樹腐爛病(Valsamali)的發(fā)生，是目前蘋果園內(nèi)最嚴重的病害之一，對蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)都帶來了不利的影響，導致果農(nóng)經(jīng)濟損失嚴重，而且這種不利影響有日趨增加的態(tài)勢，如不加以重視，將可能影響到蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3].據(jù)相關(guān)研究報道，由于樹齡老化，凍害，清園修剪不當，管理粗放等原因我國正在經(jīng)歷第5次蘋果樹腐爛病發(fā)病高峰[4].2008年曹克強等[5]對我國蘋果主要產(chǎn)區(qū)進行了蘋果樹腐爛病的調(diào)查，結(jié)果顯示，在所調(diào)查的果園中，蘋果樹腐爛病發(fā)病率達52.7%，并且有逐年加重的趨勢.甘肅省作為全國蘋果重要產(chǎn)區(qū)之一，近年來一直深受腐爛病的影響，果農(nóng)損失嚴重，薛應鈺等[6]對甘肅省主要蘋果產(chǎn)區(qū)12個縣的74個果園的腐爛病發(fā)生情況進行了調(diào)查，結(jié)果表明，在所調(diào)查的果園中蘋果樹腐爛病總體發(fā)病率為41.09%.

目前，對蘋果樹腐爛病的防治主要以化學防治為主，但長期使用化學合成農(nóng)藥不僅會殺死病原菌，而且會殺死有益微生物，破壞了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)平衡，對人類健康造成威脅、易使病原菌產(chǎn)生抗藥性等一系列問題隨之而來[7-9].生物防治具有對環(huán)境安全、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性、兼防兼治、促生等優(yōu)勢，是一種無公害植保新技術(shù)，所以利用微生物藥劑防治蘋果樹腐爛病已成為目前研究熱點之一[10-12].但是，相關(guān)學者研究認為，單一生防細菌菌劑在田間實際應用過程中存在一些劣勢，如防效易受環(huán)境因素影響，單一菌株定殖能力差，適應能力低等，而親和性好的生防菌株間混配使用可以產(chǎn)生協(xié)同增效的作用，會提高微生物防治的穩(wěn)定性和廣度[13].陳紅等[14]研究表明，某些拮抗菌株混合后，其抑菌活性明顯高于單一菌株，并能提高植物生長速率，且混合培養(yǎng)后單位含菌量有所提高.但關(guān)于芽孢桿菌用于蘋果樹腐爛病防治的研究報道較少，尤其芽孢桿菌間復配防治蘋果樹腐爛病更是未見報道.

本試驗以蘋果樹腐爛病原菌為研究對象，測定了不同生防細菌及其復配組合的抑菌率，以明確生防細菌及其組合的的抑菌效果，為新型的微生物藥劑的研制及田間應用提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試病原菌：蘋果樹腐爛病菌Valsamali，由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理學實驗室保存提供.

供試生防細菌：解淀粉芽孢桿菌TS-1203(TS-1203)Bacillusamyloliquefaciens、枯草芽孢桿菌B1(B1)Bacillussubtilis、多粘類芽孢桿菌FS-1206(FS-1206)Paenibacilluspolymyxa，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理學實驗室保存提供.

1.2 試驗方法

1.2.1 單一生防細菌發(fā)酵菌液制備 單一生防細菌發(fā)酵菌液的制備：在60 mL NB培養(yǎng)液中接種一環(huán)活化好的生防細菌，置于28 ℃、180 r/min的恒溫搖床振蕩培養(yǎng)12 h，獲得種子液.在滅菌的NYBD(60 mL)培養(yǎng)基中接種3 mL生防細菌種子液，在28 ℃、180 r/min的恒溫搖床振蕩培養(yǎng)48 h后獲得該生防細菌發(fā)酵菌液.

1.2.2 單一生防細菌發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 抑菌效果測定參考智小青等[15]采用的紙碟法和張靜等[16]采用的菌絲生長速率法，對紙碟法略作修改.接種蘋果腐爛病菌菌餅(d=5 mm)于平板中央，將分別蘸有單一生防細菌發(fā)酵菌液的圓形紙片(d=6 mm)放于距離中心位置2 cm的“十”字兩端，共計4片，以蘸有無菌水的圓形紙片作為對照，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，每個處理和對照均重復3次.

1.2.3 不同生防細菌之間親和性的測定 各細菌菌株在NA培養(yǎng)基上生長48 h后，分別接種于裝有60 mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min的恒溫搖床振蕩.振蕩培養(yǎng)36 h后，取1 mL培養(yǎng)菌液稀釋至108CFU/mL ，之后取稀釋菌液200 μL用涂布器均勻涂抹于NA培養(yǎng)基上作為被測菌株；將直徑為5 mm的無菌濾紙片放入另一培養(yǎng)菌液(1010CFU/mL)，浸泡5 s后取出作為測試菌株放入含有被測菌株的NA培養(yǎng)基上，每皿2片，放入培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)48 h之后觀察兩菌株間是否有抑菌圈出現(xiàn)(親和性).各菌株培養(yǎng)菌液均作為測試菌株和被測菌株交叉測試，每個處理重復3次.

1.2.4 復配生防細菌發(fā)酵菌液制備 復配生防細菌間發(fā)酵菌液的制備：在滅菌NYBD(60 mL)中加入不同比例生防細菌混合種子液3 mL(表1～2)，在28 ℃、180 r/min的恒溫搖床黑暗振蕩48 h后，可獲得生防細菌發(fā)酵菌液.

表1 3種生防細菌種子液復配組合

1.2.5 不同生防細菌復配發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 抑菌效果測定采用紙碟法和抑制菌絲生長速率法.接種蘋果樹腐爛病菌菌餅(d=5 mm)于平板中央，將分別蘸有復配生防細菌發(fā)酵菌液的圓形紙片(d=6 mm)放于距離中心位置2 cm的“十”字兩端，以蘸有無菌水的圓形紙片作為對照，并置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，每個處理和對照均重復3次.

表2 FS-1206(或TS-1203)與B1種子液復配組合

1.2.6 B1、FS-1206及B1與FS-1206復配后生長曲線的測定 采用比濁法[17-18]，將在NA培養(yǎng)基上活化的生防細菌B1、FS-1206接種于NB培養(yǎng)液中，置于28 ℃、180 r/min的恒溫搖床振蕩12 h，獲得種子液，然后在滅菌NYBD(60 mL)中分別加入B1、FS-1206及B1與FS-1206混合(2∶1)種子液3 mL，繼續(xù)在28 ℃、180 r/min的恒溫搖床振蕩培養(yǎng).分別于4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h時，取菌體培養(yǎng)液3 mL，用紫外分光光度計在600 nm下比色測定不同菌液的吸光值.以滅菌且未加種子液的NYBD培養(yǎng)液校零，每個處理重復3次.

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel整理，并采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件和Duncan氏新復極差法對數(shù)據(jù)進行方差分析及其差異顯著性檢驗(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 單一生防細菌發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病原菌的抑菌作用

3種生防細菌對蘋果樹腐爛病原菌的抑菌效果顯著不同(圖1和圖2).由圖1可以看出，TS-1203在3種生防細菌中對蘋果腐爛病原菌的抑菌活性最低，抑菌率為68.35，F(xiàn)S-1206趨于中間，抑菌率為74.99%.B1對腐爛病病原菌抑制效果最好，抑菌率為80.41%，與FS-1206和TS-1203都呈顯著性差異.

A:枯草芽孢桿菌B1； B：多粘類芽孢桿菌FS-1206； C:解淀粉芽孢桿菌TS-1203；D:CK.A:B.subtilis BS-1208；B：P.polymyxa FS-1206；C：B.amyloliquefaciens TS-1203.圖2 單個生防細菌發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用Figure 2 Bacteriostatic effect of single biocontrol bacterial fermentation broth on a Valsa mali

2.2 不同生防細菌間的親和性

分別將不同生防細菌培養(yǎng)菌液作為被測菌株和測試菌株交叉測試，測定3種生防細菌間的親和性，結(jié)果顯示(圖3)，B1無論作為測試菌株還是作為被測菌株，與多粘類芽孢桿菌FS-1206都表現(xiàn)為完全親和(圖3-A和圖3-B).而枯草芽孢桿菌B1作為被測菌株時，與解淀粉芽孢桿菌TS-1203完全不親和，兩菌株間有明顯抑菌圈產(chǎn)生(圖3-C)，作為測試菌株時與TS-1203基本不親和(圖3-D).當TS-1203作為被測菌株時與FS-1206基本不親和(圖3-E)，而作為測試菌株時與FS-1206間產(chǎn)生明顯抑菌圈，表現(xiàn)為完全不親和(圖3-F).綜上可知，生防細菌菌株間的互作關(guān)系是多樣化的，對一種生防細菌來說，其與另一種生防細菌的親和性可能因條件不同而各異.

A：FS-1206作為被測，B1為測試菌株；B：B1作為被測，F(xiàn)S-1206為測試菌株；C：B1作為被測，TS-1203為測試菌株；D：TS-1203作為被測，B1為測試菌株；E：TS-1203作為被測，F(xiàn)S-1206為測試菌株；F：FS-1206作為被測，TS-1203為測試菌株.A：FS-1206 as the tested strain，B1 as the test strain；B：B1 as the tested strain，F(xiàn)S-1206 as the test strain；C：B1 as the tested strain，TS-1203 as the test strain；D：TS-1203 as the tested strain，B1 as the test strain；E：TS-1203 as the tested strain，F(xiàn)S-1206 as the test strain；F：FS-1206 as the tested strain，TS-1203 as the test strain.圖3 3種生防細菌間的親和性測定Figure 3 Determination of affinity among three biocontrol bacteria

2.3 復配生防細菌發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病原菌的抑菌作用

由圖4可知，TS-1203、FS-1206與B1以不同比例復配后發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果不同，當TS-1203、FS-1206與B1復配比例為2∶3∶1時，在所有復配比例中抑菌效果最好，抑菌率為78.14%，與其他復配比例抑菌率相比差異顯著.而單一生防菌株B1發(fā)酵菌液對腐爛病原菌抑菌率達80.41%，顯著高于3菌株所有復配比例，說明此3種生防細菌混合復配后對腐爛病菌的抑制效果無相加增效作用.

A：1∶1∶1；B：1∶2∶2；C：1∶3∶3；D：2∶1∶2；E：2∶2∶3；F：2∶3∶1；G：3∶1∶3；H：3∶2∶1；I：3∶3∶2；J：B1；K：FS-1206；L：TS-1203；圖上不同小寫字母表示經(jīng) Duncan氏新復極差法檢驗在0.05水平差異顯著.Different lowercase letters in figure indicate that the significant differences at 0.05 level by Duncan's new complex range test.圖4 3種生防細菌復配對蘋果樹腐爛病菌的抑菌作用Figure 4 Antibacterial effect of three biocontrol bacteria combinations on Valsa mali

由圖5可知， 當不親和組合菌株TS-1203與B1復配比例為2∶3時，其復配發(fā)酵菌液對腐爛病病原菌抑制率為45.62%，顯著高于其他復配比例.但TS-1203與B1復配后其任何比例下發(fā)酵菌液抑菌率都顯著低于單一生防菌株.

A:1∶1；B:1∶2；C:1∶3；D:2∶1；E:3∶1；F:2∶3；G:3∶2；H:B1；I:TS-1203；圖上不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復極差法檢驗在0.05水平差異顯著.Different lowercase letters in figure indicate that the significant differences at 0.05 level by Duncan's new complex range test.圖5 B1與TS-1203復配發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用Figure 5 Inhibitory effect of mixed fermentation broth of B1 and ts-1203 on Valsa mali

將親和組合菌株B1與FS-1206以不同比例復配，當B1與FS-1206復配比例為2∶1時，其復配發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌抑制率達86.52%，顯著高于單一菌株及其他復配比例(圖6).

A:1∶1；B:1∶2；C:1∶3；D:2∶1；E:3∶1；F:2∶3；G:3∶2；H:B1；I:FS-1206；圖上不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復極差法檢驗在0.05水平差異顯著.Different lowercase letters in figure indicate that the significant differences at 0.05 level by Duncan's new complex range test.圖6 B1與FS-1206復配發(fā)酵菌液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌作用Figure 6 B1 and FS-1206 compound fermentation broth have bacteriostatic effect on Valsa mali

綜上可知，B1、FS-1206、TS-1203 3種生防細菌不同組合、不同比例復配時，對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果不同.B1、 FS-1206與TS-1203不同比例復配時，其所有復配比例發(fā)酵菌液抑菌率均顯著低于單一生防細菌B1；B1與TS-1203不同比例復配時，其抑菌率都顯著低于兩種單一生防細菌發(fā)酵菌液；只有當親和組合B1與FS-1206復配且復配比例為2∶1時對腐爛病原菌的抑制效果最好(圖6)，與單一菌株相比能顯著提高對腐爛病菌的抑菌活性.

2.4 B1、FS-1206及B1與FS-1206復配后生長曲線的測定

用紫外分光光度計在600 nm下分別比色測定B1、FS-1206及B1與FS-1206復配后不同菌液的吸光值，結(jié)果表明，3種菌液生長規(guī)律相似，在前16 h其生長速度緩慢，處于調(diào)整期，此時FS-1206的D600值為0.455，B1為0.656，B1∶FS-1206=2∶1D600為0.856；在NYBD培養(yǎng)液下發(fā)酵培養(yǎng)16 h后，菌株開始快速繁殖，各菌液濃度明顯增加，進入生長對數(shù)期.在培養(yǎng)40 h后，F(xiàn)S-1206的D600值為1.940，B1D600值為2.182，B1∶FS-1206=2∶1復配菌液D600為2.682，其菌體生長開始趨于穩(wěn)定.在培養(yǎng)48 h之后，各培養(yǎng)菌液吸光值開始下降，出現(xiàn)了菌體生物量減少的現(xiàn)象，進入菌體生長衰亡期.由圖6可以看出，3種菌液在相同培養(yǎng)條件下，在48 h時其吸光值都達到峰值，F(xiàn)S-1206、B1及B1與FS-1206復配D600分別為1.962、2.238、2.725，說明生防細菌菌株B1與FS-1206以2∶1復配時其生長、菌體繁殖速率及菌體數(shù)量都要明顯高于單一菌株.

圖7 FS-1206、B1及B1和FS-1206混配生長曲線Figure 7 Growth curves of FS-1206，B1，and B1 and FS-1206

3 討論

目前為止，大多數(shù)關(guān)于微生物防治植物病害的研究都還處于實驗室階段，其中限制生物防治穩(wěn)定應用于田間的一個重要原因就是生防微生物在田間防治效果不穩(wěn)定，受環(huán)境因素影響大.有研究表明，不同生防細菌具有不同的作用機制、不同生長需求、對環(huán)境不同的適應能力，所以將不同生防細菌菌株混合培養(yǎng)使用，可有效提高生物防治在田間的防效及穩(wěn)定性[19-20].但不同生防細菌的混合使用并不一定能提高對病原菌的抑制效果，菌株間若存在拮抗性則會影響對植物病害的防效及穩(wěn)定性，若混合使用的生防細菌菌株彼此間不產(chǎn)生拮抗性，表現(xiàn)親和，那其混合使用后就能夠在一定程度上提高對植物病害的防治效果[21-24].本試驗選用的3種生防細菌均能對蘋果樹腐爛病菌產(chǎn)生拮抗作用，其中以B1對腐爛病原菌抑制效果最好.

本試驗3株細菌菌株間親和性測定結(jié)果表明，F(xiàn)S-1206與B1表現(xiàn)為完全親和，其他兩組組合間不親和.將此3種生防細菌以不同組合不同比例復配后作用于蘋果樹腐爛病病原菌發(fā)現(xiàn)，完全親和菌株B1與FS-1206以2∶1復配時，對蘋果樹腐爛病的抑菌效果最優(yōu)，顯著高于單一菌株.這說明不同拮抗菌株混合使用時，菌株間的不同作用機制和互作關(guān)系會對植物病害的防治效果產(chǎn)生影響，當生防細菌菌株間表現(xiàn)為完全親和時，其混配使用對植物病害的防治效果會提高，這與陳志誼等[25]、傅瑩等[26]的研究結(jié)果一致.本研究分別通過對FS-1206、B1及FS-1206與B1以2∶1混合各菌液生長曲線的測定，結(jié)果表明，兩親和性好的菌株FS-1206與B1復配后，其菌體生長速度、分裂繁殖速率、活菌菌體數(shù)量均顯著高于單一生防細菌.所以，當兩菌株間親和性好，混合發(fā)酵培養(yǎng)時，單位含菌量會有所提高，并可能分泌多種拮抗物質(zhì)，其混合作用于植物病害時可能不僅僅是簡單的累加，而是有一定的協(xié)同增效作用，這與陳紅等[ 25]、申愛榮等[15]的研究結(jié)果相似.

4 結(jié)論

綜上，多粘類芽孢桿菌FS-1206與枯草芽孢桿菌B1復配發(fā)酵菌液在蘋果樹腐爛病的生物防治方面具有良好的應用前景.此外，室內(nèi)試驗缺乏強有力的說服力，對于生防細菌復配組合對蘋果樹腐爛病的田間防效還需進一步試驗研究.