辛可啟，聶澤健，萬敏艷，年芳，唐德富

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

動物腸道微生物組成了非常復(fù)雜的生物體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，并在腸道中承擔(dān)調(diào)節(jié)免疫、病原體防御和物質(zhì)代謝等作用，不僅與腸道健康關(guān)系密切，還與動物的呼吸系統(tǒng)、骨骼和腎臟等多器官、多系統(tǒng)之間相互作用和影響[1].健康動物腸道菌群間按一定比例相互制約、相互依存、相互影響形成平衡的生態(tài)系統(tǒng)[2].當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境和外壞境發(fā)生改變，會引起腸道菌群失調(diào)或微生態(tài)失衡.早期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧結(jié)構(gòu)、動物年齡、動物飼養(yǎng)管理方式均可影響動物腸道微生物區(qū)系的動態(tài)穩(wěn)定[3-4].

硒元素是動物生長必需微量礦物元素，主要在小腸內(nèi)吸收代謝，多數(shù)由腸道微生物進(jìn)行同化、還原、甲基化等代謝轉(zhuǎn)化為無機(jī)硒，而一部分無機(jī)硒鹽又被還原成單質(zhì)硒或有機(jī)硒化合物[5-7].Juniper等[8]發(fā)現(xiàn)在禽畜日糧中添加枯草芽抱桿菌和富硒酵母，可以改善畜禽腸道的微生物結(jié)構(gòu).高溫環(huán)境下仔豬日糧中添加富硒酵母后腸道中乳酸桿菌的含量極顯著增加[9-10].同樣在肉雞飼糧中將酪酸梭菌與面包酵母硒聯(lián)用可促進(jìn)肉雞腸道中雙歧桿菌的生長，降低腸球菌和大腸桿菌的數(shù)量[11].早期關(guān)于有機(jī)硒的應(yīng)用研究主要集中在對肉雞生產(chǎn)性能、肉品質(zhì)、組織硒沉積、免疫機(jī)能和抗氧化性能方面[12-15]，而硒對腸道微生物區(qū)系影響的研究鮮有報道，且早期研究僅采用傳統(tǒng)技術(shù)方法檢測幾種微生物的豐度變化，缺乏對腸道微生態(tài)系統(tǒng)性和全面性評價，應(yīng)用高通量測序技術(shù)可以避開微生物分離培養(yǎng)的過程，能夠準(zhǔn)確、快速、高通量地解讀微生物群體的多樣性與豐度，在測定動物腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)，研究動物與腸道菌群間的互作關(guān)系，發(fā)掘新的、具有特定功能的腸道微生物方面呈現(xiàn)巨大的優(yōu)勢[16].為此，本試驗(yàn)旨在通過飼養(yǎng)試驗(yàn)和高通量測序技術(shù)評估有機(jī)硒對肉仔雞生長性能和腸道微生物區(qū)系的影響，為有機(jī)硒在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

有機(jī)硒(酵母硒)購自商業(yè)公司，商品名為Lalmin Se 2000，硒含量為0.20%；試驗(yàn)用肉仔雞苗品種為‘科寶505’白羽肉雞，購于寶雞大成禽業(yè)有限公司.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)為單因素試驗(yàn)設(shè)計，將216只健康、體質(zhì)量接近的0日齡‘科寶505’肉仔雞隨機(jī)分為3個處理組，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)12只公雞，分別飼喂含有機(jī)硒0、0.6、1.2 mg/kg的3種飼糧，飼養(yǎng)試驗(yàn)為42 d，分為前期(0～21 d)和后期(22～42 d)2個階段飼養(yǎng)，并測定各期內(nèi)肉仔雞平均采食量、平均體增重和料重比.

1.3 飼糧配方

試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼糧配方參考中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T33-2004)配制.配方計算時，原料中干物質(zhì)、粗蛋白、鈣、磷為實(shí)測值，其他成分參考中國飼料成分?jǐn)?shù)據(jù)庫.試驗(yàn)飼糧為粉料.基礎(chǔ)飼糧配方組成及營養(yǎng)水平見表1.

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)飼養(yǎng)管理參照《科寶肉雞飼養(yǎng)管理手冊》.采用三層疊籠飼養(yǎng).試驗(yàn)中所有試驗(yàn)雞自由采食和飲水，每日飼喂3次.每日及時統(tǒng)計死淘雞只和采食量，定期使用消毒劑對試驗(yàn)雞舍進(jìn)行消毒處理，包括雞籠、地面、墻面、窗戶、糞板及其他工具，并每隔3 d帶雞消毒1次.定期清理糞板，保持雞舍內(nèi)外的空氣清潔.

1.5 樣品采集及指標(biāo)測定

1.5.1 腸道內(nèi)容物樣品采集 于試驗(yàn)的第42天，以重復(fù)為單位，每組抽取與平均體質(zhì)量相近的1只雞宰殺，用滅菌手術(shù)剪分離盲腸和回腸，并將其內(nèi)容物裝入2 mL凍存管中，迅速投入液氮罐中，-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存，備腸道微生物測序.

1.5.2 腸道微生物總DNA的提取與檢測 腸道微生物總DNA采用商業(yè)公司基因組DNA試劑盒提取.所提取總DNA的濃度大于30 ng/μL，基因DNA的總量大于50 ng.基于Illumina HiSeq測序平臺對16S rDNA V3-V4高變區(qū)進(jìn)行雙端測序.

表1 基礎(chǔ)飼糧配方組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)，%)

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)生產(chǎn)性能數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件One-Way ANOVA模塊進(jìn)行顯著性分析，用Dancan法預(yù)混料每千克全價料提供：VA 11 000 IU，VD33 025 IU，VE 22 mg，VK32.2 mg，VB11.65 mg，VB26.6 mg，VB63.3 mg，VB1217.6 μg，煙酸22 mg，泛酸13.2 mg，葉酸0.33 mg，生物素88 μg，F(xiàn)e 48 mg，Zn 96 mg，Mn 101mg，Cu 10 mg，I 0.95 mg.配方中營養(yǎng)水平數(shù)值均為計算值.

Provided per kilogram of diet：VA 11 000 IU；VD33 025 IU；VE 22 mg；VK32.2 mg,VB11.65 mg,VB26.6 mg,VB63.3 mg,VB1217.6 μg；pantothenic acid 13.2 mg；folic acid 0.33 mg；biotin 88 μg，F(xiàn)e 48 mg；Zn 96 mg；Mn，101 mg；Cu，10 mg；I，0.95 mg.

進(jìn)行多重比較.腸道微生物測序結(jié)果采用QIIME(version 1.8.0)軟件對97%相似水平的OUT序列進(jìn)行聚類分析，并在門、屬二個不同水平上統(tǒng)計每個樣品的群落組成并繪圖，分別計算Ace指數(shù)、Chaol指數(shù)及Simpson指數(shù)，比較各組間微生物區(qū)系的豐富度和多樣性.

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)硒添加水平對肉仔雞生長性能的影響

由表2可以看出，與對照組比較，0.6 mg/kg有機(jī)硒組飼養(yǎng)后期(22～42 d)和全期(0～42 d)肉仔雞體質(zhì)量均顯著提高(P<0.05),且1.2 mg/kg有機(jī)硒組全期體質(zhì)量也顯著改善(P<0.05)，而0.6 mg/kg和1.2 mg/kg有機(jī)硒組料重比在飼養(yǎng)前期(0～21 d)、后期和全期均顯著低于對照組(P<0.05).添加有機(jī)硒對肉仔雞采食量均無顯著影響(P>0.05).

表2 有機(jī)硒添加水平對肉仔雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 有機(jī)硒對肉仔雞腸道微生物區(qū)系的影響

2.2.1 OTU列表生成及注釋分析 由圖1可知，HA組共測得微生物51個OTU，HB組為49個OTU，HC組為47個OTU，而HA組、HB組與HC組的交叉序列為47個OTU，分別占HA、HB、HC組的92.16%、95.92%、100%，HA、HB、HC組的差異序列分別為4個OTU、2個OTU和0個OTU.MA組共測得微生物103個OTU，MB組為108個OTU，MC組為101個OTU，MA組、MB組與MC組的交叉序列為101個OTU，分別占MA、MB、MC組的98.06%、93.52%、100%，而MA、MB、MC組的差異序列分別為2個OTU、7個OTU和0個OTU.

由圖2可見，HA組共測得微生物72個OTU，HB組為75個OTU，HC組為65個OTU；而HA組、HB組與HC組的交叉序列為8個OTU，分別占HA、HB、HC組的11.11%、10.67%、12.31%，而HA、HB、HC組的差異序列分別為64個OTU、67個OTU和57個OTU.MA組共測得微生物176個OTU，MB組為87個OTU，MC組為103個OTU；而MA組、MB組與MC組的交叉序列為6個OTU，分別占MA、MB、MC組的3.40%、6.90%、5.83%，而MA、MB、MC組的差異序列分別為170個OTU、81個OTU和97個OTU.

HA(回腸，0 mg/kg有機(jī)硒)；HB(回腸，0.6 mg/kg有機(jī)硒)；HC(回腸，1.2 mg/kg有機(jī)硒)；MA(盲腸，0 mg/kg有機(jī)硒)；MB(盲腸，0.6 mg/kg有機(jī)硒)；MC(盲腸，1.2 mg/kg有機(jī)硒).HA(Ileum，0 mg/kg organic selenium)；HB(Ileum，0.6 mg/kg organic selenium)；HC(Ileum，1.2 mg/kg organic selenium)；MA(Cecum，0 mg/kg organic selenium)；MB(Cecum，0.6 mg/kg organic selenium)；MC(Cecum，1.2 mg/kg organic selenium).圖1 OTU交集維恩圖(細(xì)菌)Figure 1 Venn diagram of OTU intersection (bacteria)

2.2.2 Alpha多樣性分析 采用Alpha多樣性指數(shù)對各樣品的豐富度和多樣性進(jìn)行比較.從表3可以看出，各組間回腸細(xì)菌和真菌Ace、Chao1、Simposn、Shannon等多樣性指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05).HA組Chao1與Ace指數(shù)最高，說明微生物的物種總數(shù)和群落的豐度高，其Shannon指數(shù)最高且Simpson指數(shù)最低，表明群落的多樣性較高.同樣比較真菌的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HC組Chao1與Ace均最高，說明HC組具有較高的物種總數(shù)和群落豐度.

表3 有機(jī)硒對回腸細(xì)菌和真菌α多樣性指數(shù)的影響

由表4可以看出，各組間盲腸Ace、Chao1、Simposn、Shannon等多樣性指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05).通過比較MA、MB、MC組細(xì)菌α多樣性發(fā)現(xiàn)，各組間Ace、Chao1、Simposn、Shannon等指數(shù)值均較接近，說明微生物的物種總數(shù)、群落豐度和多樣性均一致.然而盲腸真菌α多樣性結(jié)果顯示，MA組Ace、Chao1和Shannon多樣性指數(shù)均為最高，而Simposn值最低，說明MA組較MB和MC組具有較高的物種總數(shù)和群落豐度，而且多樣性較好，但未達(dá)到顯著性差異水平(P>0.05).

HA(回腸，0 mg/kg有機(jī)硒)；HB(回腸，0.6 mg/kg有機(jī)硒)；HC(回腸，1.2 mg/kg有機(jī)硒)；MA(盲腸，0 mg/kg有機(jī)硒)；MB(盲腸，0.6 mg/kg有機(jī)硒)；MC(盲腸，1.2 mg/kg有機(jī)硒).HA(Ileum，0 mg/kg organic selenium)；HB(Ileum，0.6 mg/kg organic selenium)；HC(Ileum，1.2 mg/kg organic selenium)；MA(Cecum，0 mg/kg organic selenium)；MB(Cecum，0.6 mg/kg organic selenium)；MC(Cecum，1.2 mg/kg organic selenium).圖2 OTU交集維恩圖(真菌)Figure 2 Venn diagram of OTU intersection (fungi)

表4 有機(jī)硒對盲腸細(xì)菌和真菌Alpha多樣性指數(shù)的影響

2.2.3 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析 對各處理組物種在門層次進(jìn)行豐度統(tǒng)計可知(圖3)，MA組、MB組和MC組厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)分別占82.19%、11.42%、 2.31%、1.36%、80.36%、12.38%、1.48%、1.08%和1.20%、13.26%、2.28%、1.60%.同樣發(fā)現(xiàn)HA組、HB組和HC組的厚壁菌門、擬桿菌、藍(lán)細(xì)菌、放線菌門分別89.61%、4.24%、0.215%、0.82%，91.01%、6.52%、0.51%、0.36%和91.36%、4.02%、0.26%、0.19%.

圖3 多樣品門類物種分布圖Figure 3 Phylum species distribution of multi-sample

由圖4可知，從屬層面來分析，盲腸和回腸中主要的微生物屬是乳桿菌(Lactobacillus)、腸球菌(Enterococcus)、擬桿菌(Eubacterium)和棒狀桿菌(Corynebacterium)，乳酸菌屬在回腸中占優(yōu)勢，HC組乳酸菌屬占該菌屬的64.66%，在盲腸中很少.

圖4 多樣品屬類物種分布圖(細(xì)菌)Figure 4 Genus species distribution of multi-sample (bacteria)

由圖5可知，在門層次對MA組、MB組和MC組的物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，MA、MB和MC的壺菌門(Chytridiomycota)，子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)分別占0、75.79%、8.31%、0.10%，0、85.06%、5.27%、1.24%和0、72.47%、8.26%、0.02%.而HA、HB和HC組壺菌門、子囊菌門、擔(dān)子菌門和球囊菌門分別占0.22%、83.68%、2.84%、0.08%，0、83.42%、6.61%、0.01%和0、85.98%、6.18%、0.03%.

由圖6可知，主要真菌微生物有青霉屬(Penicillium)、分子孢子菌屬(Cladosporium)、念珠菌(Candida)和曲霉屬(Aspergillus)，毛霉菌(Mucor)在盲腸中沒有發(fā)現(xiàn)，青霉屬(Penicillium)在MC組占7.90%，HC組占25%.

圖5 多樣品門類物種分布圖(真菌)Figure 5 Phylum species distribution of multi-sample (fungi)

3 討論

硒元素是一種重要的微量礦物元素，構(gòu)成若干氧化酶的活性中心.本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加有機(jī)硒能顯著提高肉仔雞體質(zhì)量和飼料轉(zhuǎn)化率，可能是由于試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧中硒元素含量(估算值為0.08 mg/kg)相對肉雞需要量(0.3 mg/kg)缺乏所致，但本試驗(yàn)中全期未見典型硒缺乏癥，同時也說明肉仔雞對硒的耐受性相對較好.但也有報道指出添加有機(jī)硒對肉雞的生產(chǎn)性能無明顯改善作用[17-18]，這是由于其試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料中硒含量達(dá)0.15 mg/kg，短期內(nèi)能夠滿足肉仔雞的生長需要所致.

圖6 多樣品屬類物種分布圖(真菌)Figure 6 Genus species distribution of multi-sample (fungi)

現(xiàn)有資料關(guān)于有機(jī)硒對動物腸道微生物影響的報道較少.Marina等[19]以高通量測序的方法檢測食用缺硒(硒含量0.1 μg/g)、足硒(硒含量0.4 μg/g)和富硒(硒含量2.25 μg/g)3種食物的小鼠腸道內(nèi)菌群后發(fā)現(xiàn)，相比于缺硒和足硒飲食，富硒飲食使得小鼠體內(nèi)的微生物種類更加豐富.本試驗(yàn)檢測肉雞回腸細(xì)菌和真菌多樣性也發(fā)現(xiàn)類似的變化趨勢(HC組Simposn指數(shù)最高而Shannon指數(shù)最低)，但未達(dá)到顯著性水平.

本試驗(yàn)中盲腸OUT數(shù)高于回腸，同時在回腸和盲腸的菌群中，均以厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻門為主，其中厚壁菌門主導(dǎo)地位，這與Xiao等[20]、林奕岑等[21]、繞時庭等[22]報道結(jié)果相似.盲腸和回腸微生物組成的差異可能是腸道功能差異的原因和結(jié)果，也可能反映了先天或適應(yīng)性免疫反應(yīng)介導(dǎo)的宿主選擇.厚壁菌門是健康肉雞腸道中含量最多的菌群.厚壁菌門在腸道或糞便中作為主要菌門在貓、狗、馬等動物中也有報道.據(jù)報道，厚壁菌門與脂肪、蛋白的消化有關(guān)[23-25].同時，本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)盲腸和回腸中主要的微生物屬是乳酸桿菌、腸球菌、擬桿菌和棒狀桿菌，乳酸菌屬在回腸中占絕對優(yōu)勢(60%以上).該屬細(xì)菌因具有合成諸多碳水化合物降解酶(如果膠降解酶、糖苷水解酶、多糖水解酶)的能力，參與肉雞的營養(yǎng)代謝過程，有益于抑制腸道大腸桿菌和沙門氏菌的增值，改善肉仔雞的生長發(fā)育[26].賈建英等[27]發(fā)現(xiàn)初產(chǎn)母豬攝入0.5 mg/kg的酵母硒比攝入0.2 mg/kg酵母硒明顯提高了仔豬盲腸乳酸桿菌的豐度，降低有害菌數(shù)量.類似的結(jié)果劉紅露等[11]和秦順義等[28]均有報道.

研究結(jié)果表明，各處理組真菌門類以壺菌門、子囊菌門、擔(dān)子菌門、球囊菌門為主，其中子囊菌門在盲腸和回腸中均占主導(dǎo)地位，且MC組和HC組相比對照組均有所提高.子囊菌可以引起植物纖維素物質(zhì)的分解，有助于消化[29].從屬層次看盲腸和回腸中主要真菌微生物有青霉屬、分子孢子菌屬、念珠菌和曲霉屬，而致病菌毛霉菌在盲腸中沒有發(fā)現(xiàn).通過對比發(fā)現(xiàn)添加有機(jī)硒后改善了回腸和盲腸真菌多樣性，但無明顯的規(guī)律可循，且改善程度較小.腸道中真菌物種組成受多種因素影響.周本翔等[30]發(fā)現(xiàn)草魚腸道真菌物種組成主要受到食物的影響，門類以子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門、壺菌門和球囊菌門為主，且子囊菌門是主要優(yōu)勢類群.溫雪婷等[31]通過比較不同生長速率肉雞盲腸真菌結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)低體質(zhì)量組盲腸致病菌毛霉菌豐度較高.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，日糧添加有機(jī)硒能顯著改善肉仔雞的生長性能，綜合考慮生長性能及飼料成本，添加量為0.6 mg/kg較為適宜；盲腸OUT數(shù)高于回腸，添加1.2 mg/kg有機(jī)硒對腸道中細(xì)菌、真菌的物種總數(shù)和群落豐度均有改善效果，但未達(dá)到顯著性水平.