武曉英，劉地，李娜，郝雪峰，曹貴東，劉桂蘭，喬宏萍

(1.太原師范學(xué)院生物系，山西 晉中 030619；2.山西瑞象生物藥業(yè)有限公司，山西 太原 030032；3.天津渤海農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)聯(lián)合研究院有限公司，天津 300308)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease COPD)，是一種連續(xù)進入呼吸系統(tǒng)的空氣受到阻礙的疾病.該病會導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)發(fā)生慢性炎癥，進而損傷肺部功能，降低機體免疫力，使修復(fù)和防御機能不能正常運轉(zhuǎn)[1].已有研究報道，COPD的發(fā)病過程可能與體內(nèi)存在的免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)，細胞因子是免疫系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)劑和效應(yīng)劑，而機體相關(guān)細胞因子參與了COPD的發(fā)病機制[2].細胞因子IL-17在COPD患者發(fā)病中主要發(fā)揮促炎癥功能，引起肺部的炎癥反應(yīng)[3].IL-17還可誘導(dǎo)肺組織細胞分泌IL-6和TNF-α等細胞因子，加重炎癥反應(yīng)[4].目前常用的COPD治療藥物是支氣管舒張劑為糖類皮質(zhì)激素，有嚴重的副作用會導(dǎo)致呼吸肌疲勞和肌肉萎縮等.在我國，大量的中藥資源被廣泛研究應(yīng)用于對抑郁癥[5]、過敏性皮炎[6]、肺炎、腸炎、癌癥[7]等疾病的治療.因其價格便宜，副作用低，很少產(chǎn)生抗藥性[8-9]的獨特優(yōu)點，展現(xiàn)出更廣闊的研究前景.甘草被記載在多個國家藥典中，是一種有著悠久歷史的中草藥，在醫(yī)藥、食品和工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用[10].現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[11]，甘草具有抗菌、抗病毒、抗炎癥、鎮(zhèn)咳、抗氧化、抗癌等多種活性功能[9,12].已有研究人員從甘草中共提取分離得到300多種黃酮類混合物、20余種三萜皂苷類化合物及多糖成分[13].到目前為止，雖然中藥中沒有明確針對COPD的治療藥物，但某些中藥中的有效成分如多糖類、揮發(fā)油類、生物堿類、黃酮等對其有一定的治療效果[9,11,14].因此試驗采用甘草多糖對COPD進行治療，通過對細胞因子和抗氧化性的檢測，以尋求COPD新的治療方法，為呼吸道炎癥藥理作用的研究提供技術(shù)和理論上的支持.

1 材料與方法

1.1 試驗動物

昆明種SPF級小鼠30只，4～5周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心.

1.2 試驗材料

甘草由山西瑞象生物藥業(yè)有限公司提供，為常規(guī)入藥的主根部分，產(chǎn)地甘肅.

1.3 主要儀器與試劑

血清細胞因子IL-17、IL-6、IL-10和TNF-α檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；抗氧化指標T-SOD、GSH-Px、T-AOC活性及MDA檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；肺組織細胞因子IL-17、IL-6、IL-10和TNF-α檢測試劑盒(上海西唐生物科技有限公司).

Tecan M200 PRO多功能酶標儀(瑞士Tecan)；CX43奧林巴斯顯微鏡(日本Olympus)；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；RM2235徠卡組織切片機(德國Leica)；Alpha1-4 LD Plus真空冷凍干燥機(德國Martin Chris)；Scientz-IID超聲波粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司).

1.4 方法

1.4.1 試驗設(shè)計與小鼠COPD模型建立 30只健康的小鼠隨機分為3組，每組10只稱質(zhì)量記錄，分別為對照組(C組)、致病組(COPD組)和治療組(L+COPD組).

COPD模型建立：將3組小鼠飼養(yǎng)于30 cm×25 cm×25 cm的自制煙熏箱中，C組不處理，自由采食飲水；COPD組和L+COPD組每次點燃3支香煙，重復(fù)1次，每次持續(xù)時間1 h，每日早中晚各處理1次，30 d后小鼠出現(xiàn)呼吸急促、打噴嚏、撓鼻和腹肌抽搐等癥狀后停止處理.

多糖治療：C組和COPD組不治療，自由采食飲水；L+COPD組小鼠每天灌喂50 mg/kg甘草多糖[15]，連續(xù)10 d，末次給藥24 h后采用摘眼球法取小鼠血樣凍存于-20 ℃冰箱以測定細胞因子和抗氧化性能，解剖小鼠取氣管和肺組織制備切片用于組織病理學(xué)檢測.

1.4.2 甘草多糖的制備 采用水提醇沉法制備甘草粗多糖.取100 g甘草中藥飲片適度粉碎裝于1 000 mL燒杯中，蒸餾水浸泡過夜(藥材與水的體積比1∶7)，次日強火加熱至微沸后改用文火，保持30 min，6 000 r/min下離心收集水提上清液，沉淀加水500 mL再次煎煮后離心棄沉淀，合并2次水提上清液；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮水提上清液至25 mL，加入2倍體積冰冷無水乙醇，4 ℃下靜置過夜，用布氏漏斗真空抽濾沉淀，無水乙醇洗滌2～3次，真空冷凍干燥沉淀得到多糖粗提物.

1.4.3 小鼠血清、肺組織細胞因子含量測定 ELISA雙抗夾心法檢測血清中細胞因子IL-17、IL-6、IL-10和TNF-α的含量.試驗所需試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，嚴格按照試劑盒中操作說明進行，首先制作標準品的標準曲線，再根據(jù)樣品的值計算出樣品的相應(yīng)濃度.

ELISA雙抗夾心法檢測肺組織中細胞因子IL-17、IL-6、IL-10和TNF-α的含量.組織勻漿上清液的制備方法：小鼠肺組織樣品用無菌生理鹽水進行反復(fù)清洗，去除附著的其它組織后，用濾紙吸干并稱取0.5 g組織樣加生理鹽水5 mL進行勻漿，離心沉淀收集上清液進行細胞因子檢測，試驗所需試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，試驗操作嚴格按照說明書進行.

1.4.4 小鼠血清、肺組織抗氧化指標檢測 除血清外，肺組織制備成10%的組織勻漿，4 ℃下，15 000 r/min離心15 min，取上清液供T-SOD、GSH-Px、T-AOC活性及MDA含量的檢測，操作方法按照所購試劑盒說明書進行.

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組小鼠生理體征變化及剖檢觀察

生理體征變化：造模前，小鼠機體健康，精神狀態(tài)良好，活潑好動，反應(yīng)靈敏，正常飲食飲水，沒有呼吸急促，打噴嚏等不適狀態(tài)；造模4周中，從第2周開始COPD組與L+COPD組小鼠有明顯生理反應(yīng)，活動頻率減弱，反應(yīng)遲鈍，身體瘦弱，毛發(fā)發(fā)黃并且沒有光澤，小鼠出現(xiàn)了呼吸急促，打噴嚏，撓鼻等癥狀，C組小鼠飲食活動正常；治療期，灌藥治療10 d中觀察到L+COPD組小鼠進食和飲水逐步增加，精神好轉(zhuǎn)，活動量加大，較COPD組有較大的改觀，但與C組相比生長緩慢.

小鼠剖檢觀察結(jié)果顯示：C組小鼠肺部鮮紅，形態(tài)完整，無水腫現(xiàn)象，肺組織彈性良好；COPD組小鼠的肺部，有水腫現(xiàn)象，彈性下降，顏色暗沉，并有黑色斑點；經(jīng)甘草多糖灌喂小鼠治療后，L+COPD組小鼠肺組織與COPD組相比水腫現(xiàn)象減輕，黑色斑點明顯減少.

2.2 甘草多糖對COPD小鼠血清中細胞因子分泌的影響

由表1可知，C組小鼠血清中促炎癥細胞因子IL-17、IL-6和TNF-α的含量顯著低于L+COPD組(P<0.05)，極顯著低于COPD組(P<0.01)，COPD組IL-17、IL-6和TNF-α的含量顯著高于L+COPD組(P<0.05)；L+COPD組小鼠抑制炎癥細胞因子IL-10的含量顯著高于C組(P<0.05)，極顯著高于COPD組(P<0.01)，C組IL-10含量顯著高于COPD組(P<0.05).

表1 不同處理組小鼠血清中細胞因子分泌的比較

2.3 甘草多糖對COPD小鼠血清抗氧化性能的影響

表2結(jié)果顯示，小鼠灌胃甘草多糖后，L+COPD組血清中T-SOD的含量極顯著高于C組和COPD組(P<0.01)，COPD組顯著高于C組(P<0.05)；L+COPD組血清中GSH-Px和T-AOC的含量極顯著高于C組(P<0.01)，顯著高于COPD組(P<0.05)，COPD組顯著高于C組(P<0.05)； L+COPD組血清中MDA的含量顯著低于COPD組(P<0.05)，顯著高于C組(P<0.05)，C組極顯著低于COPD組(P<0.01).

2.4 甘草多糖對COPD小鼠肺組織細胞因子分泌的影響

由表3可知，比較不同試驗組肺組織中促炎癥細胞因子IL-17、IL-6和TNF-α的含量，L+COPD組顯著高于C組(P<0.05)，顯著低于COPD組(P<0.05)，COPD組極顯著高于C組(P<0.01)；比較抑制炎癥細胞因子IL-10的含量，L+COPD組極顯著高于COPD組(P<0.01)，顯著高于C組(P<0.05)，C組顯著高于COPD組(P<0.05).

表2 不同處理組小鼠血清抗氧化性能的比較

表3 不同處理組小鼠肺組織中細胞因子分泌的比較

2.5 甘草多糖對COPD小鼠肺組織抗氧化性能的影響

表4結(jié)果顯示，比較不同試驗組中肺組織T-SOD的含量，L+COPD組極顯著高于C組和COPD組(P<0.01)，COPD組顯著高于C組(P<0.05)；L+COPD組肺組織中GSH-Px和T-AOC的含量極顯著高于C組(P<0.01)，顯著高于COPD組(P<0.05)，COPD組顯著高于C組(P<0.05)；L+COPD組肺組織中MDA的含量極顯著低于COPD組(P<0.01)，顯著高于C組(P<0.05)，C組極顯著低于COPD組(P<0.01).

2.6 相同組別血清與肺組織中細胞因子和抗氧化力的比較

由圖1可知，在相同組別中，促炎癥細胞因子IL-17在血清和肺組織中的含量差異不顯著(P>0.05)；IL-6含量在C組肺組織中顯著低于血清(P<0.05)，在COPD組和L+COPD組中極顯著低于血清(P<0.01)；IL-10與TNF-α在肺組織的含量顯著低于血清中的含量(P<0.05).血清中IL-17含量的變化與肺組織的損傷有很大的相關(guān)性，可以作為肺損傷的一個檢測指標.

表4 不同處理組小鼠肺組織中抗氧化性能的比較

與血清中細胞因子含量比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極其顯著(P<0.01).Compared with serum，* indicates significant difference(P<0.05)；** indicates extremely significant difference(P<0.01).圖1 血清與肺組織中IL-17，IL-6，TNF-α和IL-6含量的比較Figure 1 Comparison of IL-17，IL-6，TNF-α，IL-6 levels between serum and lung tissues

圖2結(jié)果可知，在相同組別中比較血清與肺組織的抗氧化力，結(jié)果顯示，抗氧化指標T-SOD在肺組織的含量顯著高于血清(P<0.05)；GSH-Px和T-AOC在C組中肺組織的含量顯著高于血清(P<0.05)，在COPD組和L+COPD組中肺組織的含量極顯著高于血清(P<0.01)；MDA在C組和L+COPD組中肺組織的含量顯著高于血清(P<0.05)，在COPD組組中肺組織的含量極顯著高于血清(P<0.01).因此，肺組織在受到損傷時，通過提高自身抗氧化力修復(fù)損傷可能是最主要的修復(fù)方式.

3 討論

全球生態(tài)環(huán)境破環(huán)和空氣質(zhì)量的下降，COPD呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢.COPD是一種可控的吸入性肺組織異常疾病[16]，相關(guān)細胞因子的失衡參與了COPD的發(fā)病機制[3-4,17].Afzail等在早期研究中已證實，細胞因子失衡可加重自身免疫性疾病的炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致COPD急性加重過程[18].許多中藥有效成分可以通過促進相關(guān)免疫細胞分泌白介素、腫瘤壞死因子等細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[19-20].已有研究報道，利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥，甘草黃酮能通過調(diào)節(jié)IL-10、IL-6和TNF-α抑制LPS引起的肺部炎癥[21].在該試驗中通過煙熏誘導(dǎo)COPD小鼠模型[17]，小鼠出現(xiàn)呼吸急促現(xiàn)象，剖檢觀察小鼠呼吸道粘液增多，肺組織水腫，通過對血清和肺組織促炎癥細胞因子IL-17、IL-6和TNF-α的測定，COPD組小鼠的含量極顯著升高(P<0.01)，抑制炎癥細胞因子IL-10含量極顯著降低(P<0.01)，存在細胞因子失衡引起肺組織炎癥反應(yīng).采用甘草多糖治療后，L+COPD組血清與肺組織中IL-17、IL-6和TNF-α的含量顯著降低(P<0.05)，IL-10含量極顯著上升(P<0.01)，試驗結(jié)果與Zaporozhets[22]利用海藻多糖和劉晟文[23]利用槲皮素進行大鼠急性肺組織炎癥損傷修復(fù)作用的研究結(jié)果一致.試驗同時比較了相同組別血清與肺組織中細胞因子含量的差異，結(jié)果顯示除IL-17外，其它被檢測細胞因子在肺組織的含量都顯著低于血清中的含量，提示IL-17可能是COPD小鼠檢測的標志物，此外，機體的組織器官自身免疫在炎癥損傷修復(fù)中同樣起著很重要的作用.

與血清中細胞因子含量比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極其顯著(P<0.01).Compared with serum，* indicates significant difference(P<0.05)；** indicates extremely significant difference(P<0.01).圖2 血清與肺組織中T-SOD，Gpx，T-AOC，MDA含量的比較Figure 2 Comparison of T-SOD，Gpx，T-AOC，MDA levels between serum and lung tissues

機體的炎癥反應(yīng)可以刺激ROS生成增多，從而造成機體的氧化應(yīng)激損傷[24-25].T-SOD和GSH-Px是機體清除氧化損傷所產(chǎn)生ROS的重要酶，MDA是膜脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物，T-AOC可以用來檢測機體的抗氧化能力.LPS能引起機體產(chǎn)生高水平的ROS和MDA，導(dǎo)致細胞和組織氧化損傷[26].大量的研究證實植物提取物中的活性成分對LPS引起的氧化損傷有很好的修復(fù)作用[27-28]，但對COPD氧化損傷修復(fù)的報道很少.該試驗采用煙熏法進行小鼠COPD建模，除引起炎癥反應(yīng)外，同樣導(dǎo)致機體組織的氧化損傷，抗氧化性能檢測結(jié)果顯示小鼠血清和肺組織中T-SOD、GSH-Px、T-AOC的含量極顯著提高(P<0.01)，MDA含量顯著下降(P<0.05).在采用甘草多糖對COPD模型小鼠治療后，L+COPD組小鼠無論在血清還是肺組織中，T-SOD極顯著高于COPD組和C組(P<0.01)，GSH-Px和T-AOC的含量顯著高于COPD組，極顯著高于C組；MDA的含量極顯著低于COPD組(P<0.01)，顯著高于C組.因此，甘草多糖可以有效提高COPD模型小鼠血清與肺組織的抗氧化能力.同時，該試驗比較了相同組別中血清和肺組織的抗氧化性能，抗氧化力檢測指標中的T-SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA在肺組織中都極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)高于血清中的含量，提示在炎癥治療中可能肺組織器官自身的抗氧化損傷修復(fù)是關(guān)鍵因素.

4 結(jié)論

COPD模型小鼠通過甘草多糖的灌胃治療，促炎癥細胞因子IL-17、IL-6和TNF-α分泌降低，抑制炎癥細胞因子IL-10分泌升高，抗氧化能力提高.組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，小鼠肺組織雖沒有完全恢復(fù)正常，但較COPD組損傷修復(fù)明顯得到改善.因此，甘草多糖能夠有效修復(fù)COPD小鼠肺組織的炎癥及氧化損傷.