柯晴 羅瞾 岑洪

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院淋巴血液及兒童腫瘤內(nèi)科

B細(xì)胞淋巴瘤是一種起源于B淋巴細(xì)胞的淋巴瘤，臨床上常見的類型包括彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及套細(xì)胞淋巴瘤［1］。利妥昔單抗聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療治療B細(xì)胞淋巴瘤取得了理想的療效，但仍有20%～30%的患者因腫瘤耐藥死亡［2］。利妥昔單抗是基因工程人鼠嵌合單克隆抗體，作用于淋巴細(xì)胞表面的CD20抗原，可顯著改善濾泡性淋巴瘤患者生存期，也使更多的侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤患者得到根治機(jī)會(huì)。在臨床上雖然許多患者初始治療對利妥昔單抗敏感，但最終仍會(huì)復(fù)發(fā)，因此利妥昔單抗獲得性耐藥已成為B細(xì)胞淋巴瘤治療面臨的最大挑戰(zhàn)之一。西達(dá)本胺是我國自主設(shè)計(jì)和制造的新一代酰胺類組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑，通過表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，恢復(fù)耐藥腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性［3］。臨床上觀察到西達(dá)本胺對復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞淋巴瘤患者有效［4］，但其作用機(jī)制仍不明確。本研究探討西達(dá)本胺在體外對利妥昔單抗耐藥的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jeko-1/R增殖的影響及其可能的作用機(jī)制，為耐藥B細(xì)胞淋巴瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jeko-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，Jeko-1/R細(xì)胞由親本Jeko-1細(xì)胞經(jīng)利妥昔單抗體外濃度梯度遞增方式培養(yǎng)誘導(dǎo)構(gòu)建而成。細(xì)胞置于含100 U/mL青霉素-鏈霉素，10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Jeko-1/R細(xì)胞培養(yǎng)于含50 μg/mL利妥昔單抗的培養(yǎng)基中維持耐藥表型［5］。

RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Gibco公司。細(xì)胞增殖與毒性檢測試劑盒（CCK-8）購自上海七海復(fù)泰公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自日本TaKaRa公司?？挂阴；疕3、H4抗體、內(nèi)參β-actin及其相對應(yīng)的二抗均購自Abcam公司。健康人血清作為人補(bǔ)體來源。利妥昔單抗（rituximab，美羅華，10mg/mL）為商品化的羅氏公司產(chǎn)品。西達(dá)本胺由深圳微芯公司贈(zèng)送，溶于DMSO配置成10 mmol/L的儲(chǔ)存液，保存在-20℃冰箱。

1.2 CCK-8法檢測藥物對細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，以每孔100 μL接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組和不同濃度用藥組，其中單藥組分別加入 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL利妥昔單抗或 4 μmol/L、8 μmol/L 和 16 μmol/L西達(dá)本胺；兩藥聯(lián)合組加入100 μg/mL利妥昔單抗及8 μmol/L西達(dá)本胺，對照組接種細(xì)胞但只給予同體積的培養(yǎng)基而不加藥物，另設(shè)不含細(xì)胞只含培養(yǎng)基的空白對照組。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度（OD），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=［（OD對照-OD實(shí)驗(yàn)）/（OD對照-OD空白）］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 RT-PCR檢測細(xì)胞CD20mRNA的表達(dá)水平

取培養(yǎng)48h后的各組細(xì)胞，按TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA。取1 μL cDNA配制RT-PCR體系進(jìn)行PCR檢測。引物序列由上海生工生物公司設(shè)計(jì)和合成，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列：GAPDH上游為 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游為 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；CD20 上游為 5′-ATGAAAGGCCCTATTGCTATG-3′，下游為 5′-GCTGGTTCACAGTTGTATATG-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后制作融解曲線。采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4 Western blot法檢測組蛋白H3、H4乙?；?/h3>

取Jeko-1/R細(xì)胞，加入不同濃度（0μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L）西達(dá)本胺，48 h 后收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取40～60 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入相應(yīng)一抗（稀釋比例1∶1 000），4℃孵育過夜。次日加入二抗（稀釋比例 1∶8 000），室溫孵育60 min，用顯色劑顯色成像。用Image Lab軟件對目的條帶和內(nèi)參條帶測量灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值表示對應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的多重比較采用Dunnett′s t檢驗(yàn)。本研究以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單藥利妥昔單抗和西達(dá)本胺對Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL）利妥昔單抗和（4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L）西達(dá)本胺分別單獨(dú)處理Jeko-1細(xì)胞48 h后均呈劑量依賴式抑制細(xì)胞增殖，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=38.533，P<0.001；F=17.968，P=0.003）。進(jìn)一步多重比較顯示，25 μg/mL利妥昔單抗和4 μmol/L西達(dá)本胺處理后的細(xì)胞增殖抑制率均低于其余相應(yīng)藥物作用組（均P<0.001）。

不同濃度西達(dá)本胺作用48 h后呈劑量依賴式抑制Jeko-1/R細(xì)胞增殖，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=51.456，P<0.001），且4 μmol/L西達(dá)本胺處理后的細(xì)胞增殖抑制率均低于其余相應(yīng)藥物作用組（均P<0.001）。但不同濃度西達(dá)本胺處理Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞的增殖抑制率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）；而不同濃度利妥昔單抗處理Jeko-1/R細(xì)胞的增殖抑制率均低于Jeko-1細(xì)胞（均P<0.001），其中當(dāng)利妥昔單抗作用濃度為 100 μg/mL 時(shí)，Jeko-1、Jeko-1/R 細(xì)胞增殖抑制率均最高，選擇100 μg/mL濃度利妥昔單抗進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1、圖2。

2.2 西達(dá)本胺聯(lián)合利妥昔單抗對Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，西達(dá)本胺聯(lián)合利妥昔單抗呈時(shí)間依賴式抑制Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞增殖，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.272，P=0.001；F=76.105，P<0.001），多重比較顯示，48 h、72 h細(xì)胞增殖抑制率均高于24 h（均P<0.01）；各時(shí)間點(diǎn)兩者聯(lián)合處理Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞的增殖抑制率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P>0.05），見表 1、圖 3。48 h時(shí)，兩者聯(lián)合處理Jeko-1、Jeko-1/R細(xì)胞的增殖抑制率均高于單藥西達(dá)本胺［（79.57±7.27）%vs（66.49±6.33）%，t=-2.800，P=0.049；（74.35±9.65）%vs（64.15±5.09）%，t=-3.815，P=0.019］。

圖1 利妥昔單抗抑制Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞增殖Fig.1 Rituximab inhibited the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells

圖2 西達(dá)本胺抑制Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞增殖Fig.2 Chidamide inhibited the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells

表1 西達(dá)本胺聯(lián)合利妥昔單抗對Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞增殖的影響（%）Tab.1 Effects of chidamide combined with rituximab on the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells（%）

圖3 西達(dá)本胺聯(lián)合利妥昔單抗對Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of chidamide combined with rituximab on the proliferation of Jeko-1 and Jeko-1/R cells

2.3 西達(dá)本胺對Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞CD20 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，西達(dá)本胺在48 h呈劑量依賴式上調(diào)Jeko-1/R細(xì)胞CD20 mRNA的表達(dá)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=346.123，P<0.001），多重比較顯示，4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L 西達(dá)本胺作用時(shí)Jeko-1/R細(xì)胞CD20 mRNA的表達(dá)水平均高于0 μmol/L（均 P<0.01）。見圖 4。

圖4 西達(dá)本胺對Jeko-1和Jeko-1/R細(xì)胞CD20 mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of chidamide on the expression of CD20 mRNA in Jeko-1 and Jeko-1/R cells

2.4 西達(dá)本胺對Jeko-1/R細(xì)胞組蛋白H3、H4乙?；降挠绊?/h3>

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，西達(dá)本胺在48 h可以劑量依賴式上調(diào)Jeko-1/R細(xì)胞的H3和H4的乙?；剑医M間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=690.077，P<0.001；F=847.194，P<0.001），多重比較顯示，4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L西達(dá)本胺作用時(shí)H3和H4的乙?；骄哂?0 μmol/L（均 P<0.01）。見圖 5。

3 討論

圖5 西達(dá)本胺對Jeko-1/R細(xì)胞組蛋白H3、H4乙?；降挠绊慒ig.5 Effect of chidamide on the acetylation levels of histone H3 and H4 in Jeko-1/R cells

B細(xì)胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤最常見的類型，利妥昔單抗聯(lián)合化療是有效的治療方案，但仍有部分患者不敏感，逆轉(zhuǎn)利妥昔單抗耐藥成為B細(xì)胞淋巴瘤臨床治療中亟待解決的問題之一。HDAC抑制劑作為新一代靶向抗腫瘤藥物，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中顯示了良好療效［6-7］。其中 Vorinostat、Romidepsin、Panobinostat等HDAC抑制劑在國外已獲批用于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤治療［8］。一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示利妥昔單抗聯(lián)合Vorinostat能抑制惰性B細(xì)胞淋巴瘤疾病進(jìn)展［9］。西達(dá)本胺也是一種新型的口服酰胺類HDAC抑制劑，可選擇性抑制 HDAC1、2、3 和 10 的活性［10］。西達(dá)本胺還可以提高組蛋白H3、H4乙酰化水平，引發(fā)染色質(zhì)重塑，并由此產(chǎn)生表觀遺傳改變，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，西達(dá)本胺還具有誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞分化、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的上皮間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化等功能，在恢復(fù)耐藥腫瘤細(xì)胞對藥物敏感性和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等方面發(fā)揮作用［11］。目前在肝癌、白血病以及膀胱癌中西達(dá)本胺也顯示出一定療效［12-14］。2015年西達(dá)本胺被批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)/難治性外周T細(xì)胞淋巴瘤的治療［10，15-16］。但HDAC抑制劑在B細(xì)胞淋巴瘤治療中的價(jià)值仍不明確。為探索西達(dá)本胺在B細(xì)胞淋巴瘤耐藥中的作用，本研究分別采用不同濃度利妥昔單抗和西達(dá)本胺處理B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Jeko-1和耐藥細(xì)胞株Jeko-1/R，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度利妥昔單抗和西達(dá)本胺在48 h時(shí)均呈劑量依賴式抑制Jeko-1細(xì)胞增殖，但對于耐藥Jeko-1/R細(xì)胞，利妥昔單抗并未觀察到明顯的增殖抑制作用，提示Jeko-1/R對利妥昔單抗耐藥；而西達(dá)本胺作用Jeko-1/R細(xì)胞卻同樣表現(xiàn)出劑量依賴式增殖抑制作用，且與Jeko-1細(xì)胞的增殖抑制率比較差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明西達(dá)本胺對利妥昔單抗耐藥細(xì)胞發(fā)揮了同效的增殖抑制作用，提示西達(dá)本胺可能成為B細(xì)胞淋巴瘤耐藥患者的治療選擇。

利妥昔單抗是針對B細(xì)胞CD20抗原的一種人鼠嵌合性單克隆抗體，能特異性地與B細(xì)胞表面的CD20抗原結(jié)合，通過多種機(jī)制清除體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)CD20表達(dá)丟失可導(dǎo)致利妥昔單抗耐藥，在利妥昔單抗治療后復(fù)發(fā)的淋巴瘤患者及利妥昔單抗耐藥患者中均發(fā)現(xiàn)CD20表達(dá)降低或丟失［17-22］；甚至部分初治患者也觀察到CD20低表達(dá)，且與不良預(yù)后有關(guān)［19］，因此認(rèn)為CD20低表達(dá)或缺失可能是導(dǎo)致利妥昔單抗治療失敗的原因。而關(guān)于CD20表達(dá)下調(diào)，有研究認(rèn)為可能是由HDAC使組蛋白脫乙酰化所致，也有研究發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑可上調(diào)CD20表達(dá)，克服不同類型B細(xì)胞淋巴瘤患者先天性和獲得性的利妥昔單抗耐藥性，增強(qiáng)利妥昔單抗的細(xì)胞毒作用［3-4，21］。此外，去甲基化藥物可恢復(fù)CD20 mRNA和蛋白表達(dá)，提示表觀遺傳機(jī)制有可能是利妥昔單抗治療后CD20下調(diào)的基礎(chǔ)。也有研究認(rèn)為HDAC抑制劑聯(lián)合利妥昔單抗可能具有協(xié)同作用，且與上調(diào)B淋巴瘤細(xì)胞 CD20表達(dá)有關(guān)［3，23-24］。以上研究結(jié)果提示聯(lián)合應(yīng)用HDAC抑制劑可能是克服利妥昔單抗耐藥B細(xì)胞淋巴瘤的有效策略。本研究采用西達(dá)本胺聯(lián)合利妥昔單抗分別處理Jeko-1細(xì)胞和耐藥細(xì)胞株Jeko-1/R，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與西達(dá)本胺單藥相比，兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)耐藥Jeko-1/R細(xì)胞增殖抑制率明顯提高，且與非耐藥Jeko-1細(xì)胞增殖抑制率相當(dāng)，提示西達(dá)本胺能恢復(fù)Jeko-1/R細(xì)胞對利妥昔單抗的敏感性。進(jìn)一步觀察西達(dá)本胺對耐藥Jeko-1/R細(xì)胞CD20 mRNA表達(dá)及組蛋白H3、H4乙酰化水平的影響，發(fā)現(xiàn)西達(dá)本胺以劑量依賴的方式上調(diào)Jeko-1/R細(xì)胞CD20 mRNA的表達(dá)，說明西達(dá)本胺可恢復(fù)耐藥細(xì)胞對利妥昔單抗的敏感性，達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的目的，且可能是通過上調(diào)組蛋白H3、H4的乙?；侥孓D(zhuǎn)耐藥。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)西達(dá)本胺可逆轉(zhuǎn)利妥昔單抗耐藥性，與利妥昔單抗聯(lián)合應(yīng)用可抑制利妥昔單抗耐藥淋巴瘤細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與西達(dá)本胺上調(diào)利妥昔單抗耐藥細(xì)胞組蛋白H3、H4乙酰化水平有關(guān)。兩者聯(lián)合用藥為治療復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞淋巴瘤提供了新的思路。