謝環(huán)宇，宮金偉，趙明星，孫繼勇

肝細胞癌(HCC)的發(fā)病機制復雜。盡管當今全球醫(yī)學界在癌癥診治方面不斷取得各種突破，但據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的相關數(shù)據(jù)顯示，全球每年因肝癌死亡的患者人數(shù)高達一百萬，是當前國際醫(yī)學界尚未攻克的重大病種之一。隨著現(xiàn)代醫(yī)學研究的不斷深入，納米技術、基因技術和電磁技術不斷被應用于肝癌的臨床診治領域。采用納米磁性材料進行腫瘤熱療法成為了當前惡性腫瘤臨床診治領域較為熱門的新技術[1]。我們將納米生物技術與磁場作用相結合，探討了極低頻率電磁場(extremely low frequency electromagnetic fields, ELF-EMF)下，磁性納米載體對體外肝癌細胞生長的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、試劑和儀器 成年雌性裸鼠30只，成年雄性裸鼠30只，體質(zhì)量為18～20 g，購于哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心。PEG-PEI/Fe3O4納米磁流體由哈爾濱醫(yī)科大學外科研究中心制備。Bel-7402細胞(ATCC HB8065)由哈爾濱醫(yī)科大學提供。RPMI 1640培養(yǎng)基和10%FBS購于武漢普諾賽生命科技有限公司，ELF-EMF由哈爾濱工業(yè)大學研制，額定電壓為220 v，單相頻率為100 Hz，由可調(diào)變壓器和電阻調(diào)節(jié)輸出磁場強度。

1.2 裸鼠肝癌模型的建立及處理方法 取對數(shù)生長期的人肝癌Bel-7402細胞混懸液，細胞數(shù)為2×106/0.2 ml，接種于裸鼠頸后皮下。以皮下結節(jié)>0.5 cm為成瘤標準，大約1 w后成瘤。隨機將實驗動物分成對照組、磁場組和納米磁流體組，每組20只。在對照組，不行任何處理；在磁場組，動物僅接受磁場作用，不接受其他處理；在納米磁流體組，在小鼠瘤內(nèi)直接注射PEG-PEI/Fe3O4納米磁流體0.1 ml，并接受0.7 mT的磁場作用1 h，2次/d，連續(xù)15 d。

1.3 腫瘤體積、腫瘤組織質(zhì)量、抑瘤率的測定及病理學檢查 用游標卡尺測量腫瘤長徑a(mm)和與之垂直的短徑b(mm)，腫瘤體積(V)=0.5×ab2。在實驗結束時，稱量剝離的腫瘤組織質(zhì)量，計算抑瘤率【K(%)】=(對照組平均腫瘤質(zhì)量-實驗組平均腫瘤質(zhì)量)/對照組平均腫瘤質(zhì)量×100%。將剝?nèi)〉哪[瘤組織制作病理標本，行HE染色。

1.4 血清細胞因子檢測 在實驗15 d，采集裸鼠靜脈血，采用放射免疫法(北京富眾科技發(fā)展有限公司)檢測血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、白細胞介素 2受體(sIL-2R)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)水平。

2 結果

2.1 三組腫瘤體積比較 在納米磁流體處理后7 d和15 d，裸鼠腫瘤體積顯著小于其他兩組(P<0.05，表1)。

表1 三組腫瘤體積比較

2.2 各組腫瘤質(zhì)量變化及抑瘤率比較 經(jīng)處理后，對照組、磁場組和納米磁流體組裸鼠腫瘤質(zhì)量分別為[(2.0±0.2)g、(1.4±0.1)g和(0.8±0.1)g，P<0.05]；經(jīng)處理后磁場組和納米磁流體組抑瘤率分別為26.2%和56.9%(P<0.05)。

2.3 各組血清學指標比較 在干預后，納米磁流體組裸鼠血清VEGF、HIF-1α、sIL-2R和MMP-2水平較磁場作用組顯著降低(P<0.05，表2)。

表2 各組血清學指標比較

2.4 各組病理學表現(xiàn) 對照組腫瘤細胞生長旺盛，細胞密度極大，排列紊亂。細胞/核質(zhì)比大，核染色深且異型性顯著(圖1A)；磁場組細胞生長受限，細胞排列稀疏，間質(zhì)增多，凋亡細胞較多，有壞死區(qū)形成(圖1B)；納米磁流體組腫瘤組織呈大片壞死，腫瘤細胞顯著減少，部分區(qū)域見少量腫瘤細胞殘存，排列極稀疏(圖1C))。

圖1 各組裸鼠腫瘤病理學表現(xiàn) (HE，×400)

3 討論

目前，對于HCC的發(fā)病機制研究仍未獲得更多的進展。對于手術治療以及射頻消融、動脈血管灌注栓塞等局部治療的效果仍存在腫瘤復發(fā)等問題[2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學研究的不斷深入，納米技術、基因技術以及電磁技術不斷被應用于肝癌的臨床診治領域。采用納米磁性材料的腫瘤熱療法成為了當前惡性腫瘤臨床診治領域較為熱門的新技術[1]。在醫(yī)學領域中對磁性載體材料的要求有著一定的特性，F(xiàn)e3O4是一種生物相容性較好、制備相對簡單、磁性強的磁性材料，所以其使用較多。大量研究顯示，磁性載體材料對肝癌細胞的凋亡及細胞增殖等生物學效應均有影響。磁性納米材料定向治療肝癌是利用其超順磁性在外加定磁場照射下定位磁場指向位置，磁性納米材料不僅可負載治療藥物，還可在外加磁場作用下對病變部位發(fā)揮熱殺傷作用[3]。當前，有關實驗研究顯示，磁性納米粒子協(xié)同外加磁場對不同細胞系肝癌細胞的增殖和凋亡等生物學效應均有影響。有研究指出[4]，低功率電磁場對腫瘤細胞的生長有一定的抑制作用，但其作用機制尚不明確。伴隨電磁學在醫(yī)學上的不斷應用以及納米技術的不斷研究，多學科綜合治療惡性腫瘤已成為研究熱點。我們把磁場作用與納米生物技術相結合，探討了在ELF-EMF下磁納米載體對裸鼠種植性肝癌生長的影響。

有研究表明[5]，ELF-EMF可使膽囊癌細胞DNA鏈斷裂損傷，進而抑制膽囊癌細胞的增殖。也有研究指出[6]，ELF-EMF可使人肝癌細胞系BEL-7402細胞生長停滯于G2/M期，并且與細胞周期停滯相關的p53蛋白表達均增高。還有研究表明[7]，ELF-EMF可增加人鱗狀上皮癌細胞系細胞微核形成率和細胞凋亡率。從以上研究可以看出，ELF-EMF可抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。而PEI可促進納米磁流體與腫瘤細胞DNA分子的結合，有利于轉染和基因治療，并且PEG可提高納米磁流體的生物相容性，促進細胞對納米顆粒的吞噬，提高轉染效率，降低PEI的毒性等作用[8]。

在本研究中，我們在納米磁流體組裸鼠瘤體內(nèi)直接注射PEG-PEI/Fe3O4納米磁流體，并同對照組和磁場組進行比較。從表1可以看出，納米磁流體組腫瘤的生長受到顯著抑制，顯著優(yōu)于磁場組或對照組，并且時間越長抑制效果越顯著。在腫瘤質(zhì)量上，納米磁流體組顯著變輕，顯著優(yōu)于另外兩組(P<0.05)。在抑瘤率上，納米磁流體組顯著高于磁場組，且隨著時間延長，抑瘤率越高(P<0.05)，說明ELF-EMF下Fe3O4納米磁流體可顯著抑制小鼠種植性肝癌細胞的生長。腫瘤細胞的生長與細胞因子間有著密切的關系。VEGF是促血管生長因子，其參與缺血缺氧組織及器官血管生成，可以特異性作用在血管內(nèi)皮細胞，參與到腫瘤血管的新生[9,10]。HIF-1α為氧依賴性轉錄因子，組織在缺氧狀態(tài)下可促進其在腫瘤細胞中的表達，促進腫瘤血管生成及腫瘤細胞轉移[11,12]。sIL-2R是反應機體淋巴細胞活性的一個重要指標，其可脫落于惡性腫瘤細胞表面而進入血液循環(huán)[13,14]。MMP-2是MMPs家族的一個成員，其可降解基質(zhì)和膠原蛋白，能夠突破基質(zhì)屏障，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，還可通過促進血管生成進一步促進腫瘤細胞生長[15-17]。本研究在經(jīng)磁場作用后，納米磁流體組和磁場組裸鼠血清VEGF、HIF-1α、sIL-2R和MMP-2水平均較磁場作用前顯著降低，但納米磁流體組降低更顯著(P<0.05)，說明ELF-EMF下Fe3O4納米磁流體可顯著抑制腫瘤新生血管生成。此外，從病理學檢查可以看出，納米磁流體組腫瘤細胞呈現(xiàn)大片凝固性壞死，出現(xiàn)大片紅染無結構的壞死組織區(qū)域，顯著優(yōu)于磁場組，說明ELF-EMF下Fe3O4納米磁流體可顯著抑制小鼠種植性肝癌細胞增殖、促進其凋亡，與相關研究結果基本一致[18-20]。

綜上所述，ELF-EMF下Fe3O4納米磁流體對裸鼠種植性肝癌細胞血管生成有著顯著的抑制作用，可顯著抑制腫瘤生長和肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡，對臨床研究有著重要的意義。