邱稼飛 王 璇 張南海 趙 亮,2 張列兵 吳 薇 籍保平 周 峰*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院/植物源功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，北京 100083)

痤瘡是一種慢性毛囊皮脂腺疾病，主要由于毛囊皮脂腺角化速度加快，誘發(fā)粉刺形成，造成毛囊內(nèi)的無(wú)氧環(huán)境，引起痤瘡丙酸桿菌增殖，從而誘導(dǎo)或加重痤瘡病變，其中亞油酸含量不足、皮脂中脂質(zhì)過(guò)氧化、雄激素分泌過(guò)多、外部油脂類產(chǎn)品刺激等都會(huì)引起皮膚毛囊皮脂腺角化[1]。目前痤瘡的治療方法一般為藥物治療和物理治療，我國(guó)中醫(yī)還采取內(nèi)服、外治、針灸法預(yù)防及治療痤瘡[2]。由于長(zhǎng)期服用藥物會(huì)產(chǎn)生一定副作用，因此，研究并挖掘具有改善痤瘡作用的物質(zhì)，特別是天然產(chǎn)物成為研究熱點(diǎn)。

佛手(CitrusmedicaL. var.sarcodactylisSwingle)為蕓香科柑橘屬植物，是一種藥食同源的植物，富含維生素C、佛手多糖、香豆素、橙皮苷、檸檬素油等化合物。甜橙(Citrussinensis(L.)Osbeck)為蕓香科柑橘屬植物，含有豐富的β-胡蘿卜素、維生素C、多酚類、黃酮類、生物堿等物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較強(qiáng)的抗氧化作用。果汁和揮發(fā)油是它們最常見(jiàn)的兩種產(chǎn)品形式，國(guó)外報(bào)道佛手精油具有抗菌活性[3]，佛手汁具有降血脂、抗氧化、抗炎癥等作用[4]，還有報(bào)道稱柑橘精油有抗菌、抗氧化作用[5]。因此，目前研究佛手、甜橙的果汁和揮發(fā)油對(duì)食物改善痤瘡具有重要意義。

本研究擬采用兔耳內(nèi)側(cè)涂抹油酸建立痤瘡模型[6]，研究佛手和甜橙的果汁及揮發(fā)油對(duì)兔耳痤瘡模型中兔耳組織病理學(xué)、皮脂分泌量、氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子的影響，以期為開(kāi)發(fā)無(wú)毒副作用且能改善痤瘡的佛手、甜橙產(chǎn)品提供理論依據(jù)，促進(jìn)2種植物原料向精深加工發(fā)展，提高其產(chǎn)物利用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料及試劑

SPF級(jí)雄性健康新西蘭兔66只，2.5±0.1 kg，購(gòu)買并飼養(yǎng)于北京芳元緣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK(京)2014-0012。

佛手購(gòu)于浙江金華，甜橙購(gòu)于廣東江門；復(fù)方珍珠暗瘡膠囊，陜西東泰制藥有限公司。

甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、總抗氧化能力(T-AOC)、還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、維生素E(VE)、丙二醛(MDA)試劑盒，南京建成生物工程研究所；白三烯B4(LTB4)、白介素-1α(IL-1α)、白介素-6(IL-6)試劑盒，北京科盈美科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

AY220 精密分析天平(0.000 1 g)，日本島津公司；SpectraMax M2e酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular 公司；HV-200型壓榨機(jī)，東興儀器有限公司；超低溫冰箱，中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-III循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1佛手汁制備

將佛手鮮果切成1 cm×1 cm×1 cm的小塊，壓榨取汁后置于冰箱中冷藏過(guò)夜，過(guò)濾得到佛手汁。

1.3.2佛手揮發(fā)油制備

參照《中華人民共和國(guó)藥典》揮發(fā)油測(cè)定方法[7]。將佛手果皮切成8 mm×8 mm×1 mm小塊，取一定量于圓底燒瓶中，加入4倍體積蒸餾水，采用水蒸氣蒸餾法提取2 h，收集揮發(fā)油并加無(wú)水硫酸鈉脫水，最后過(guò)濾去掉硫酸鈉即得到佛手揮發(fā)油。

1.3.3甜橙汁制備

將甜橙切成4 cm×4 cm×4 cm的小塊，壓榨取汁后置于冰箱中冷藏過(guò)夜，過(guò)濾得到甜橙汁。

1.3.4甜橙揮發(fā)油制備

將甜橙果皮切成8 mm×8 mm×8 mm小塊，取一定量于圓底燒瓶中，加入6倍體積蒸餾水，采用水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集揮發(fā)油并加入無(wú)水硫酸鈉脫水，最后過(guò)濾去掉硫酸鈉即得到甜橙揮發(fā)油。

1.3.5動(dòng)物分組及處理

新西蘭兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼喂正常維持飼料，自由采食、飲水。66只雄性新西蘭兔適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后隨機(jī)分為11組，分別為空白組、模型組、陽(yáng)性藥物組、甜橙汁低劑量組、甜橙汁高劑量組、甜橙揮發(fā)油低劑量組、甜橙揮發(fā)油高劑量組、佛手汁低劑量組、佛手汁高劑量組、佛手揮發(fā)油低劑量組、佛手揮發(fā)油高劑量組。采用每天固定時(shí)間灌胃給藥，空白組、模型組灌胃10 mL/kg生理鹽水，陽(yáng)性藥物組按照人每日服用換算，新西蘭兔每日需服陽(yáng)性藥物1.65粒，按照體積比1∶6加入蒸餾水中配制成水溶液，灌胃4 mL/kg復(fù)方珍珠暗瘡膠囊，佛手汁低高劑量組分別灌胃8.4、10.5 mL/kg，佛手揮發(fā)油低高劑量組分別灌胃0.125、0.2 mL/kg，甜橙汁低高劑量組分別灌胃8.4、10.5 mL/kg，甜橙揮發(fā)油低高劑量組分別灌胃0.125、0.2 mL/kg，試驗(yàn)周期為3周，除空白組，其余組第2周開(kāi)始用體積分?jǐn)?shù)為50%的油酸石蠟溶液涂抹于兔耳內(nèi)側(cè)耳管開(kāi)口處，每天1次，每次0.5 mL，直至試驗(yàn)結(jié)束。

試驗(yàn)結(jié)束前禁食12 h(自由飲水)，用乙醚使新西蘭兔深度昏迷，兔耳靜脈注射空氣處死。剪取兔耳痤瘡受損處，一部分用于組織學(xué)觀察，另一部分經(jīng)液氮速凍后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.6兔耳組織病理學(xué)指標(biāo)測(cè)定

肉眼及光鏡下觀察兔耳痤瘡模型兔耳受損部位組織學(xué)變化，根據(jù)毛囊擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度對(duì)兔耳組織病理學(xué)進(jìn)行分級(jí)。(-)：毛囊擴(kuò)張、炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度與正常組織相同；(+)：毛囊輕度擴(kuò)張、局灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)；(++)：毛囊中度擴(kuò)張、局灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)并出現(xiàn)多個(gè)浸潤(rùn)灶；(+++)：毛囊高度擴(kuò)張、炎細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)。

1.3.7兔耳組織生化指標(biāo)檢測(cè)

稱取兔耳組織0.5 g，破碎成小塊，按質(zhì)量體積比(m(兔耳組織)∶V(鹽水))=1∶9 g/ mL的比例加入生理鹽水制成勻漿，置于冷凍離心機(jī)中3 000 r/min離心10 min取上清液，按試劑盒要求檢測(cè)兔耳組織中TG、FFA、LTB4、IL-1α、IL-6、T-AOC、GSH、SOD、VE、MDA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示，采用SPSS 18.0軟件單因素方差分析ANOVA (one-way analysis of variance)和多重比較檢驗(yàn)分析Duncan’s分析不同組數(shù)據(jù)間顯著性，P<0.05表示數(shù)據(jù)間具有顯著差異，采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔耳組織病理學(xué)觀察

與空白組相比，油酸可使兔耳厚度增加，皮膚粗糙，毛囊口擴(kuò)張并隆起，并出現(xiàn)一定量的丘疹和膿包，且出現(xiàn)彌漫性炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)，表明痤瘡模型構(gòu)建成功。各干預(yù)組兔耳痤瘡較模型組癥狀有較明顯的改善，膿包較少出現(xiàn)，毛囊隆起較少，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，說(shuō)明陽(yáng)性藥物、甜橙汁、甜橙揮發(fā)油、佛手汁、佛手揮發(fā)油對(duì)痤瘡均有一定的改善作用，其中甜橙揮發(fā)油劑量組對(duì)痤瘡的改善作用最好，其次是佛手揮發(fā)油組，佛手汁和甜橙汁的效果較差，可能由于揮發(fā)油中改善痤瘡癥狀的有效成分含量較高[8](表1)。

(a)空白組；(b)模型組；(c)陽(yáng)性藥物組；(d)甜橙汁低劑量組；(e)甜橙汁高劑量組；(f)甜橙揮發(fā)油低劑量組；(g)甜橙揮發(fā)油高劑量組；(h)佛手汁低劑量組；(i)佛手汁高劑量組；(j)佛手揮發(fā)油低劑量組；(k)佛手揮發(fā)油高劑量組。(a) Control group; (b) Model group; (c) Positive drug group; (d) Low dose sweet orange juice group; (e) High dose sweet orange juice group; (f) Low dose sweet orange volatile oil group; (g) High dose sweet orange volatile oil group; (h) Low dose bergamot juice group; (i) High dose bergamot juice group; (j) Low dose bergamot volatile oil group; (k) High dose bergamot volatile oil group.圖1 不同處理組兔耳外觀形態(tài)Fig.1 Appearance and morphological of rabbit ear in different treatment groups

表1 不同處理組兔耳組織病理學(xué)形態(tài)變化結(jié)果Table 1 Changes in pathological morphology of rabbit ear tissue in different treatment groups 只

表1(續(xù)) 只

2.2 不同處理下兔耳組織皮脂含量變化

毛囊皮脂中甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)含量增加，可引發(fā)角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖，毛囊皮脂腺導(dǎo)管過(guò)度角化，導(dǎo)致微粉刺的形成，進(jìn)而產(chǎn)生痤瘡[9-10]。由圖2可知，模型組兔耳組織TG、FFA含量較空白組顯著增加(P<0.05)，而與模型組相比，各干預(yù)組能顯著降低TG和FFA含量(P<0.05)，同時(shí)揮發(fā)油組效果優(yōu)于果汁組，且隨著劑量的增加TG和FFA含量降低。對(duì)于TG含量，甜橙和佛手揮發(fā)油高劑量組可使其基本恢復(fù)至正常水平，與陽(yáng)性藥物組一致，對(duì)于FFA含量，甜橙揮發(fā)油高劑量組、佛手揮發(fā)油低高劑量組效果最優(yōu)，且佛手揮發(fā)油低高劑量組優(yōu)于陽(yáng)性藥物組。表明各干預(yù)組可通過(guò)降低TG和FFA對(duì)毛囊皮脂腺的刺激，達(dá)到改善油酸誘導(dǎo)痤瘡的效果。

A，空白組；B，模型組；C，陽(yáng)性藥物組；D，甜橙汁低劑量組；E，甜橙汁高劑量組；F，甜橙揮發(fā)油低劑量組；G，甜橙揮發(fā)油高劑量組；H，佛手汁低劑量組；I，佛手汁高劑量組；J，佛手揮發(fā)油低劑量組；K，佛手揮發(fā)油高劑量組。柱上不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。下圖同。A, control group; B, model group; C, positive drug group; D, low dose sweet orange juice group; E, high dose sweet orange juice group; F, low dose sweet orange volatile oil group; G, high dose sweet orange volatile oil group; H, low dose bergamot juice group; I, high dose bergamot juice group; J, low dose bergamot volatile oil group; K, high dose bergamot volatile oil group. Columns marked with different letters represent significantly different (P<0.05) within groups. The same below.圖2 不同處理組兔耳組織甘油三酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)(a)和游離脂肪酸質(zhì)量摩爾濃度(b)的變化Fig.2 Changes of triglyceride mass fraction (a) and free fatty acid molality (b) of rabbit ear tissue in different treatment groups

2.3 不同處理下兔耳組織LTB4含量變化

脂肪氧合酶的作用產(chǎn)物白三烯B4(LTB4)也能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖，還能在沒(méi)有痤瘡丙酸桿菌的情況下誘導(dǎo)并加強(qiáng)炎癥反應(yīng)[11]，痤瘡丙酸桿菌的作用是使角鯊烯分解或轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化角鯊烯[12]。張保恒[13]研究發(fā)現(xiàn)LTB4可能在尋常痤瘡發(fā)病中起重要作用，參與痤瘡的炎癥過(guò)程。由圖3可知，模型組LTB4含量是空白組的3倍左右(P<0.05)，各干預(yù)組較模型組能顯著降低LTB4含量(P<0.05)，甜橙揮發(fā)油高劑量組對(duì)LTB4含量的降低作用最顯著，且優(yōu)于陽(yáng)性藥物組。這說(shuō)明干預(yù)組能通過(guò)降低LTB4含量減輕痤瘡的炎癥反應(yīng)。

圖3 不同處理組兔耳組織白三烯B4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.3 Changes of leukotriene B4 mass fraction of rabbit ear tissue in different treatment groups

2.4 不同處理下兔耳組織IL-1α和IL-6含量變化

皮脂分泌增多會(huì)使皮膚中角鯊烯含量增加，從而刺激毛囊皮脂腺過(guò)度增殖，導(dǎo)致白介素-1α(IL-1α)、白介素-6(IL-6)等炎癥因子的釋放[14-15]，進(jìn)一步誘導(dǎo)毛囊漏斗部的角質(zhì)化，加重毛囊皮脂腺導(dǎo)管的過(guò)度角化[14]。與空白組相比，模型組IL-1α和IL-6含量顯著增加(P<0.05)(圖4)，隨著劑量的加大炎癥因子含量減少，揮發(fā)油組均優(yōu)于果汁組，甜橙和佛手揮發(fā)油高劑量組可顯著降低IL-6含量(P<0.05)，其中甜橙揮發(fā)油高劑量組效果最佳，可能甜橙揮發(fā)油降低炎癥作用更優(yōu)。綜上，揮發(fā)油各劑量組對(duì)痤瘡炎癥因子表達(dá)水平的抑制作用優(yōu)于其他干預(yù)組，可能是由于揮發(fā)油中含有較高含量的抗炎活性物質(zhì)[16]，可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)而改善痤瘡。

圖4 不同處理組兔耳組織白介素-1α(a)和白介素-6(b)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.4 Changes of interleukin-1α (a) and interleukin-6 (b) mass fraction of rabbit ear tissue in different treatment groups

2.5 不同處理下兔耳組織抗氧化能力變化

機(jī)體抗氧化能力反映了機(jī)體內(nèi)酶促及非酶促體系總的自由基清除能力和過(guò)氧化物分解能力等[17]。研究表明，痤瘡患者體內(nèi)過(guò)氧化物含量明顯增加[18]。Sarici等[19]研究表明，痤瘡患者體內(nèi)SOD含量顯著低于正常水平；Pham等[20]研究也表明痤瘡患者體內(nèi)VE含量顯著下降，可能與體內(nèi)過(guò)氧化物含量增加有關(guān)。模型組T-AOC、GSH、SOD、VE水平較空白組顯著降低(P<0.05)，其余各組均能提高這些指標(biāo)水平，隨著劑量的增大也逐漸增大，揮發(fā)油組優(yōu)于果汁組，其中甜橙揮發(fā)油高劑量組作用效果最佳，且其SOD水平優(yōu)于陽(yáng)性藥物組(圖5)?？赡苡捎趽]發(fā)油能夠更有效的保護(hù)和增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減少痤瘡患者體內(nèi)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生，且甜橙揮發(fā)油中抗氧化單體成分活性可能更高，因而抗氧化作用優(yōu)于佛手揮發(fā)油。

(a)總抗氧化能力；(b)谷胱甘肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)；(c)超氧化物歧化酶的活力；(d)維生素E質(zhì)量分?jǐn)?shù)。(a) Total antioxidant capacity; (b) Mass fraction of glutathione; (c) Activity of superoxide dismutase; (d) Mass fraction of vitamin E.圖5 不同處理組兔耳組織抗氧化指標(biāo)的變化Fig.5 Changes of antioxidant indexes of rabbit ear tissue in different treatment groups

2.6 不同處理下兔耳組織MDA含量變化

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其水平反映了機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度[21]，模型組MDA含量較空白組顯著增加(P<0.05)，說(shuō)明模型組兔耳組織中發(fā)生了脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)(圖6)。與模型組相比，甜橙、佛手揮發(fā)油組和果汁高劑量組均能顯著降低MDA含量(P<0.05)，并且隨著劑量的增加MDA含量降低，揮發(fā)油對(duì)MDA含量的降低作用優(yōu)于果汁組。說(shuō)明痤瘡患者體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致痤瘡病癥的不斷發(fā)展，而揮發(fā)油具有良好的抗氧化作用，可能有效地抑制體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，抑制痤瘡的不斷發(fā)展。

圖6 不同處理組兔耳組織丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.6 Changes of malondialdehyde mass fraction of rabbit ear tissue in different treatment groups

3 結(jié) 論

本研究采用油酸致新西蘭兔痤瘡模型評(píng)價(jià)了不同劑量甜橙揮發(fā)油、甜橙汁、佛手揮發(fā)油、佛手汁對(duì)痤瘡的干預(yù)作用。兔耳涂抹油酸2周后，兔耳皮膚粗糙且增厚，毛囊口隆起并出現(xiàn)一定量的紅色丘疹和膿包，并伴隨彌漫性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，皮脂分泌量增加，炎癥因子和MDA含量升高，抗氧化能力減弱，灌胃干預(yù)物質(zhì)后均能不同程度地降低皮脂分泌量、炎癥因子和MDA含量，增強(qiáng)抗氧化能力，從而達(dá)到改善痤瘡癥狀，隨著劑量的升高改善效果越好，且揮發(fā)油組普遍優(yōu)于果汁組，其中甜橙揮發(fā)油組效果最佳，其次是佛手揮發(fā)油組，而甜橙汁和佛手汁作用效果較差，可能是由于揮發(fā)油中改善痤瘡的有效成分的含量較高，甜橙揮發(fā)油中有效成分高于佛手揮發(fā)油。