程月 張明巖 張文博 綜述 徐暉 審校

據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率較高，并且已成為癌癥死亡的主要原因[1]。肺癌的早期診斷比較難，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期，且易發(fā)生血流轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，而大多數(shù)的非小細(xì)胞肺癌對(duì)化療的敏感性較低，肺癌的臨床治療已成為一大難題。因此闡明肺癌發(fā)生的分子機(jī)制對(duì)于提高肺癌患者生存率、改善患者的生存水平至關(guān)重要。

lncRNAs長(zhǎng)度在200 bp以上，區(qū)別于20 bp左右的miRNAs，蛋白編碼能力有限，曾被認(rèn)為是RNAs中的暗物質(zhì)，后來(lái)才發(fā)現(xiàn)這類RNAs具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)水平的作用。lncRNAs的功能和它們的亞細(xì)胞定位相關(guān)。其中有些lncRNAs定位于胞漿，除了能干擾蛋白質(zhì)翻譯后修飾、造成異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以外，還能通過(guò)ceRNAs等多種機(jī)制影響胞漿中mRNAs轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)[2]。已有研究表明lncRNAs通過(guò)ceRNAs機(jī)制在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，例如，DANCR作為ceRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-496，激活mTOR通路，促進(jìn)肺腺癌發(fā)生發(fā)展[3]，DANCR還可能是肺癌診療中的潛在生物標(biāo)志物之一[4]。因此闡明lncRNAs在肺癌中的作用機(jī)制對(duì)于尋找新的診斷標(biāo)志物以確定治療靶點(diǎn)、評(píng)價(jià)預(yù)后和改善化療方案有重要意義。

1 lncRNAs作為ceRNAs的調(diào)控機(jī)制

Salmena等[5]的假說(shuō)提出，lncRNA可作為ceRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相同的miRNA，降解靶基因的mRNA。即在轉(zhuǎn)錄后水平，同時(shí)lncRNA和miRNA富集的情況下，lncRNA 中miRNA反應(yīng)元件(microRNAs response elements，MREs)通過(guò)與mRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA來(lái)調(diào)節(jié)下游mRNA表達(dá)(圖1)，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。MREs作為RNA編碼的信使，在ceRNA機(jī)制中起重要作用，由于結(jié)合miRNA相同位點(diǎn)的lncRNA上各MREs特異的核酸序列不同，同時(shí)lncRNA上的每個(gè)MRE對(duì)同一miRNA功能的作用強(qiáng)弱不一樣，因此不同的MREs對(duì)miRNA的抑制程度也存在差異。

圖1 競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA調(diào)控機(jī)制Figure 1 Regulatory mechanism of competitive endogenous RNA

2 lncRNAs作為ceRNAs在肺癌中的研究

2.1 lncRNAs作為ceRNAs調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖

2.1.1 ZNFX1反義RNA1(ZNFX1 antisense RNA1，ZFAS1) lncRNA ZFAS1位于染色體20q13.13，Tomasz等[6]發(fā)現(xiàn)在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中，ZFAS1具有癌基因特性；能調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Zeng等[7]發(fā)現(xiàn)ZFAS1在肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且具有miR-150-5p結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)miR-150-5p具有高遷移族AT-hook2(High-mobility group AT‐hook 2，HMGA2)結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)功能缺失研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌A549和H1299細(xì)胞中，敲除ZFAS1后miR-150-5p表達(dá)升高，HMGA2表達(dá)降低，細(xì)胞增殖降低，而敲減miR-150-5p和過(guò)表達(dá)HMGA2能部分逆轉(zhuǎn)這一作用。表明ZFAS1能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-150-5p，上調(diào)HMGA2的表達(dá)，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。

2.1.2 長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA467(long intergenic non-protein coding RNA 467，linc00467) lncRNA linc00467位于染色體1q32.3，長(zhǎng)度797bp，是一種新型lncRNA。Ding等[8]發(fā)現(xiàn)linc00467在肺腺癌組織中表達(dá)升高，且其表達(dá)量可能與患者的預(yù)后相關(guān)。Cyclin D1是由CCND1基因編碼，可通過(guò)參與D-CDK4/6-RB通路促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期過(guò)渡到S期，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549和H1299的增殖[9]。通過(guò)功能缺失研究發(fā)現(xiàn)，在這兩類細(xì)胞中敲減linc00467，CCND1的表達(dá)降低。提示linc00467通過(guò)調(diào)節(jié)CCND1表達(dá)影響細(xì)胞周期。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-20b-5p過(guò)表達(dá)會(huì)降低CCND1蛋白水平，同時(shí)miR-20b-5p擁有l(wèi)inc00467或CCND1的結(jié)合位點(diǎn)，表明linc00467通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-20b-5p調(diào)控靶基因CCND1的表達(dá)，從而調(diào)控肺腺癌細(xì)胞增殖[8]。除此之外，Chang等[10]還發(fā)現(xiàn)linc00467能海綿吸附miR-4779和miR-7978，通過(guò)ceRNAs機(jī)制促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)增強(qiáng)其干細(xì)胞活性。

2.1.3 肌動(dòng)蛋白絲相關(guān)蛋白1反義RNA1(AFAP1 antisense RNA 1，AFAP1-AS1) lncRNA AFAP1-AS1位于染色體4p16.1，長(zhǎng)度6 810 bp。Huang等[11]發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1在肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)。Zhuang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)其表達(dá)會(huì)抑制肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。生物信息學(xué)分析表明miR-139-5p具有AFAP1-AS1結(jié)合位點(diǎn)，在肺腺癌A549和SPCA-1細(xì)胞中，干擾AFAP1-AS1表達(dá)后miR-139-5p表達(dá)上調(diào)，這表明在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。敲減AFAP1-AS1或過(guò)表達(dá)miR-139-5p都會(huì)使這兩類細(xì)胞增殖受到抑制，以上表明AFAP1-AS1可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-139-5p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-139-5p調(diào)節(jié)RRM2影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)DDP 和5-FU的耐藥性。

2.2 lncRNAs作為ceRNAs調(diào)控肺癌細(xì)胞凋亡

2.2.1 淋巴細(xì)胞白血病缺失基因2(Deleted in lymphocytic leukaemia 2，DLEU2) lncRNA DLEU2位于染色體13q14.2，Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)DLEU2在非小細(xì)胞肺癌患者組織和細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)DLEU2表達(dá)能促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞LLC凋亡。Liang等[14]發(fā)現(xiàn)血漿miR-30a-5p可作為肺癌早期無(wú)創(chuàng)診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。隨著進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在這兩類細(xì)胞中，下調(diào)DLEU2能顯著升高miR-30c-5p表達(dá)水平，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，證明miR-30c-5p是DLEU2的靶基因，且對(duì)其起負(fù)調(diào)控作用，表明DLEU2可作為miR-30c-5p的ceRNA。同時(shí)在這兩類細(xì)胞中，DLEU2上調(diào)能升高SOX9蛋白水平，而上調(diào)miR-30c-5p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)這一作用[13]。因此，DLEU2通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-30c-5p，上調(diào)SOX9表達(dá)，從而抑制非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞凋亡。

2.2.2 類賴氨酸氧化酶1的反義RNA1(LOXL1 antisense RNA 1，LOXL1-AS1) lncRNA LOXL1-AS1位于染色體15q24.1，在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用，且和剝脫綜合征的病程進(jìn)展相關(guān)[15]。Li等[16]發(fā)現(xiàn)LOXL1-AS1在肺腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)、且抑制肺腺癌細(xì)胞A549和SPCA-1細(xì)胞凋亡。miR-423-5p在肺腺癌細(xì)胞A549和SPCA-1中相對(duì)于在BEAS‐2B細(xì)胞中表達(dá)下降，且敲減LOXL1-AS1會(huì)增加其表達(dá)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示miR-423-5p在LOXL1-AS1有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明兩者均顯著富集于Ago2抗體。因此可以得出在肺腺癌中LOXL1-AS1可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-423-5p。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)成髓細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)錄因子第2亞型(MYB proto-oncogene like 2，MYBL2)是miR-423-5p的靶向位點(diǎn)，且由LOXL1-AS1調(diào)節(jié)。因此可以得出，LOXL1-AS1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-423-5p，調(diào)控MYBL2的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)肺腺癌癌癥進(jìn)展。

2.2.3 長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA857(long intergenic non-protein coding RNA 857，linc00857) lncRNA linc00857位于染色體10q22.3，長(zhǎng)度2 171 bp。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)linc00857在肺腺癌中表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲減linc00857會(huì)促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡。下調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1229和H838中l(wèi)inc00857表達(dá)后miR-1179表達(dá)明顯增加。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，linc00857能結(jié)合miR-1179[18]。研究表明，精子相關(guān)抗原5(Sperm-associated antigen 5，SPAG5)過(guò)表達(dá)與肺腺癌預(yù)后不良相關(guān)[19]。而且敲減linc00857抑制SPAG5轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。因此，linc00857通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-1179，調(diào)控SPAG5表達(dá)，從而影響肺腺癌細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)肺腺癌癌癥進(jìn)展，且有望成為肺腺癌治療靶點(diǎn)[18]。

2.3 lncRNAs作為ceRNAs調(diào)控肺癌細(xì)胞遷移與侵襲

2.3.1 FOXF1相鄰非編碼發(fā)育調(diào)控RNA(FOXF1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA，F(xiàn)ENDRR) lncRNA FENDRR位于染色體16q24.1。同源異型盒轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR)通過(guò)結(jié)合多梳抑制復(fù)合物2(Poly-comb repressive complexe 2，PRC2)調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因，而FENDRR能結(jié)合PRC2[20-21]，于是Xu等[22]通過(guò)類比分析得出FENDRR可能也與癌癥發(fā)生相關(guān)。

Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)FENDRR表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)，且其過(guò)表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲。通過(guò)在線生物信息學(xué)分析得出，miR-761含有一個(gè)以上FENDRR的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在FENDRR過(guò)表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-761表達(dá)受到抑制，且雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)表明兩者直接相關(guān)，由此得出FENDRR可作為miR-761的ceRNA發(fā)揮作用。Yan等[24]發(fā)現(xiàn)miR-761能以其3′-UTR與金屬蛋白酶組織抑制劑2(Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP2)mRNA結(jié)合，使TIMP2轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)減少。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)，加入miR-761抑制物會(huì)抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲，而下調(diào)TIMP2會(huì)逆轉(zhuǎn)這一作用。由此可得出，F(xiàn)ENDRR通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-761，上調(diào)TIMP2表達(dá)，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲。

2.3.2 HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR) lncRNA HOTAIR位于染色體12q13.13。研究發(fā)現(xiàn)敲減HOTAIR抑制肺癌細(xì)胞侵襲[26]。Chen等[27]通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HOTAIR與miR-217有相同的結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)表明，HOTAIR可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-217，進(jìn)而調(diào)控肺癌細(xì)胞侵襲。在線分析得出miR-217與臘腸犬同系物1(Dachshund homolog 1，DACH1)有互補(bǔ)序列，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)顯示miR-217能降低DACH1的熒光素酶活性。除此之外，過(guò)表達(dá)miR-217顯著抑制肺腺癌細(xì)胞H1299和A549的侵襲，而這一作用能被DACH1過(guò)表達(dá)所逆轉(zhuǎn)。因此，在非小細(xì)胞肺癌中HOTAIR通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-217，調(diào)控DACH1表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲，可能為非小細(xì)胞肺癌提供治療靶點(diǎn)。此外HOTAIR還能通過(guò)上調(diào)miR-613影響非小細(xì)胞肺癌的腫瘤發(fā)生，但對(duì)其下游mRNA的研究還不是很清楚[28]。

2.3.3 核旁斑裝配轉(zhuǎn)錄本1(Nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1) lncRNA NEAT1位于染色體11q13.1，包含2個(gè)亞基，NEAT1_1(3.7 kb)和NEAT1_2(23 kb)，是核旁斑的重要組成結(jié)構(gòu)，在應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞分化中起重要作用[29-32]。Wu等[33]發(fā)現(xiàn)NEAT1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，且其高表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549和H460遷移，而加入miR-98-5p類似物能逆轉(zhuǎn)這一作用；miR-98-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)減少，且miR-98-5p類似物抑制這兩類細(xì)胞遷移。有研究表明，miR-98-5p能通過(guò)結(jié)合整聯(lián)蛋白β3的3′-UTR抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移[34]。Wu等[33]還發(fā)現(xiàn)miR-98-5p能直接靶向結(jié)合NEAT1，這些結(jié)果表明NEAT1可作為miR-98-5p的ceRNA影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移。此外，絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK6)與miR-98-5p有相同的結(jié)合位點(diǎn)且直接相關(guān)。因此NEAT1通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-98-5p，調(diào)控MAPK6表達(dá)而在肺癌細(xì)胞的遷移中起重要作用。

2.3.4 肺腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(Lung adenocarcinoma associated transcript 1 ，LUADT1) LncRNA LUADT1位于染色體6q24.3，長(zhǎng)度453 bp。lncRNAs作為ceRNAs調(diào)控肺癌細(xì)胞遷移與侵襲不僅發(fā)生在非小細(xì)胞肺癌中，在小細(xì)胞肺癌中也同樣存在。Wang等[35]發(fā)現(xiàn)在小細(xì)胞肺癌組織中LUADT1表達(dá)顯著增加，miR-15a-3p在小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)減少。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LUADT1可能能與miR-15a-3p結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞SHP-77中，LUADT1能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-15a-3p，上調(diào)Twist1表達(dá)，從而促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移與侵襲。

3 小結(jié)與展望

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，如紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測(cè)序，光活性增強(qiáng)的核糖核苷交聯(lián)和免疫共沉淀，更多在肺癌中通過(guò)ceRNAs機(jī)制起調(diào)節(jié)作用的lncRNAs將被篩選出來(lái)，豐富ceRNAs假說(shuō)，進(jìn)一步探索lncRNAs在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，使lncRNAs作為肺癌的診斷標(biāo)記物和潛在的治療靶點(diǎn)而發(fā)揮重要的臨床價(jià)值。本綜述列出了一些通過(guò)ceRNAs機(jī)制在肺癌中形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的lncRNAs，希望對(duì)未來(lái)lncRNAs通過(guò)ceRNAs機(jī)制在肺癌中的研究有幫助。