尹松祥

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，尤其晚期胃癌患者預(yù)后較差，發(fā)病率及病死率在所有惡性腫瘤中位居前列，嚴(yán)重危害人類的生命健康[1-2]。在我國，胃癌在男性和女性的惡性腫瘤發(fā)病率分別居第2位和第4位，病死率居第2位[3]。早期大多數(shù)胃癌患者臨床癥狀不典型、早診率低，確診時患者多處于中晚期，導(dǎo)致患者預(yù)后較差[4]。因此，研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，篩選出胃癌早期診斷及預(yù)后的標(biāo)志物迫在眉睫[5]。Copine-8(CPNE8)作為Copines家族成員之一，分布廣泛而且高度保守，其通過依賴鈣離子結(jié)合方式在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和膜的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用[6-7]。較多研究發(fā)現(xiàn)，CPNE8參與了多種實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)改變影響患者預(yù)后[8]。目前，CPNE8在胃癌中的表達(dá)水平及生物學(xué)功能仍不清楚。因此，本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)分別檢測CPNE8在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年3月—2014年3月于仙桃職業(yè)學(xué)院附屬醫(yī)院行胃癌根治術(shù)并經(jīng)過病理證實的胃癌組織標(biāo)本144例和距癌灶邊緣5 cm以上且經(jīng)病理證實為正常胃黏膜的癌旁組織。144例患者中，男76例，女68例；≤60歲者66例，>60歲者78例；中高分化患者80例，低分化患者64例；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期83例。本研究經(jīng)仙桃職業(yè)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，在組織樣本收集之前均獲得患者知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 免疫組化

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(Streptavidin-perosidase，SP)法檢測CPNE8的表達(dá)，對石蠟塊做4 μm厚連續(xù)切片，隨后用梯度乙醇水化脫蠟，3%的過氧化氫10 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖鹽水(Phosphate buffered solution，PBS)洗滌，高溫高壓修復(fù)切片10 min，隨后滴加兔抗人CPNE8一抗(購于英國Abcom公司，1∶200)，4℃孵育過夜，次日，PBS洗滌3次，滴加二抗室溫孵育20 min。最后用二氨基聯(lián)苯胺試劑盒(福州邁新生物技術(shù)公司)對載玻片進(jìn)行染色，再通過蘇木素(福州邁新生物技術(shù)公司)復(fù)染，中性樹膠封片。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定

最終免疫組化結(jié)果判讀是基于每個標(biāo)本的染色強(qiáng)度和范圍的乘積進(jìn)行綜合評分，由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生鏡下隨機(jī)選取5個高倍鏡視野(400×)，每個視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞。染色強(qiáng)度按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分：未著色為0分；淺黃色或黃色為1分；棕黃色為2分；棕色或棕褐色為3分。染色范圍：無陽性細(xì)胞為0分；≤10%為1分；10%～50%為2分；≥51%為3分。CPNE8表達(dá)強(qiáng)度的總分評判：≥3分為高表達(dá)；<3分為低表達(dá)。CPNE8在胃癌組織中的高表達(dá)率=CPNE8在胃癌組織高表達(dá)數(shù)/總石蠟組織數(shù)×100%。

1.4 隨訪

通過電話和/或查閱病歷的方式進(jìn)行隨訪調(diào)查，所有患者隨訪至術(shù)后5年?？偵嫫?Overall survival，OS)指從出院當(dāng)日開始至因任何原因死亡或末次隨訪日期。無病生存期(Disease-free survival，DFS)指從出院開始到患者出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)或由于疾病進(jìn)展導(dǎo)致患者死亡的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件和Graphpad 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以百分率(%)表示，采用McNemar檢驗比較胃癌組織與癌旁組織中CPNE8陽性表達(dá)率，采用χ2檢驗分析CPNE8表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。生存曲線繪制和比較采用Kaplan-Meier分析和Log-rank檢驗。采用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行單因素和多因素預(yù)后分析，采用受試者工作特征(Receiver operating characteristic，ROC)曲線的曲線下面積(Area under curve，AUC)和Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測和擬合效能評價，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CPNE8在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果表明，CPNE8在胃癌組織中表達(dá)較深，呈棕褐色，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中；而在癌旁組織中染色強(qiáng)度較淺，呈淡黃色或無著色(圖1)。CPNE8在胃癌組織中陽性表達(dá)率為63.9%(92/144)，在癌旁組織中的陽性表達(dá)率為26.4%(38/144)，采用McNemar檢驗，CPNE8在胃癌組織與癌旁組織中的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=36.450，P<0.001)(表1)。

圖1 CPNE8在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)水平(SP×200)Figure 1 The expression of CPNE8 in gastric cancer and adjacent tissues(SP×200)Note：A.The expression of CPNE8 in paracancerous tissue；B.The weak expression of CPNE8 in gastric cancer tissue(-)；C.The low to moderate expression of CPNE8 in gastric cancer tissue；D.The strong expression of CPNE8 in gastric cancer tissue.

表1 CPNE8在胃癌組織及癌旁組織的表達(dá)

2.2 CPNE8表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

CPNE8的表達(dá)與胃癌患者的TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=5.993，P=0.014；χ2=6.703，P=0.009)，而與患者性別、年齡、腫瘤分化程度及T分期均無關(guān)(P>0.05)(表2)。

表2 CPNE8表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 CPNE8的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

CPNE8高表達(dá)患者的OS范圍為4～48個月，中位OS為20.0個月；CPNE8低表達(dá)患者的OS范圍為6～60個月，中位OS為43.0個月；Kaplan-Meier分析結(jié)果表明CPNE8高表達(dá)患者的OS較CPNE8低表達(dá)患者明顯縮短(χ2=23.130，P<0.001)。CPNE8高表達(dá)患者的DFS為3～45個月，中位無病生存期為16.0個月；CPNE8低表達(dá)患者的DFS為3～59個月，中位DFS為42.0個月；Kaplan-Meier分析結(jié)果表明CPNE8高表達(dá)患者的DFS較CPNE8低表達(dá)患者明顯縮短(χ2=21.570，P<0.001)(圖2)。

圖2 CPNE8表達(dá)對胃癌患者術(shù)后預(yù)后生存曲線Figure 2 The survival curve of postoperative prognosis of gastric cancer patients with CPNE8 expression

2.4 影響胃癌患者OS的危險因素分析

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和CPNE8表達(dá)可能是胃癌患者OS的影響因素(P<0.05)；進(jìn)一步采用多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CPNE8表達(dá)是影響胃癌患者OS的獨立危險因素(P<0.05)(表3，表4)。

表3 胃癌患者OS危險因素的單因素分析

表4 胃癌患者OS危險因素的多因素分析

2.5 影響胃癌患者PFS的危險因素分析

在單因素Cox回歸模型分析結(jié)果顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CPNE8表達(dá)是胃癌患者PFS的影響因素(P<0.05)；進(jìn)一步采用多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示TNM分期和CPNE8表達(dá)是影響胃癌患者PFS的獨立危險因素(P<0.05)(表5，表6)。

表5 胃癌患者PFS危險因素的單因素分析

表6 胃癌患者PFS危險因素的多因素分析

3 討論

CPNE8蛋白首次在急性髓性白血病(Acute myeloidleukemia，AML)患者中被發(fā)現(xiàn)，屬于Copines蛋白家族的成員，其與Copine-1、Copine-3、Copine-5蛋白具有相當(dāng)高的同源性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，CPNE8基因包含CPNE8-A和CPNE8-B兩種亞型，CPNE8在人體大部分組織中表達(dá)較低或不表達(dá)，在大腦、腎臟、心臟、前列腺等器官中表達(dá)較高[10-11]。CPNE8屬于鈣依賴性磷脂膜結(jié)合蛋白，其定位在細(xì)胞膜上，在物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、有絲分裂及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的生物學(xué)作用[12]。有研究報道多種腫瘤中存在CPNE8的異常表達(dá)或缺失，然而其在腫瘤中的生物學(xué)功能及其相關(guān)作用機(jī)制仍未闡明清楚。

Ramsey等[13]研究發(fā)現(xiàn)AML患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)是由于AML1等位基因出現(xiàn)易位，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)染色體上AML1基因與CPNE8基因發(fā)生融合，從而造成AML1基因的截斷突變，使其失去了轉(zhuǎn)錄激活功能，而被截斷的AML1可以阻礙細(xì)胞分化。作者推斷CPNE8基因在AML組織中發(fā)生截斷突變使得治愈后的急性白血病復(fù)發(fā)，其可能是增殖的負(fù)調(diào)控因子。Bu等[14]發(fā)現(xiàn)CPNE8參與乳腺的惡性進(jìn)程，其表達(dá)水平與乳腺癌患者的臨床病理特征密切相關(guān)。Nagasawa等[15]通過對27例日本卵巢癌患者標(biāo)本進(jìn)行RNA測序，通過主成分分析(PCA)對測序結(jié)果進(jìn)行功能注釋分析，并在PCA的基礎(chǔ)上對所選基因進(jìn)行敲除實驗，結(jié)果表明，敲除CPNE8和BHLHE41的表達(dá)可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力。表明下調(diào)CPNE8表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其可能作為“原癌基因”參與卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展。另外，有研究報道m(xù)icroRNAs可作為一類在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用的重要調(diào)節(jié)因子，miR-375被認(rèn)為是多種腫瘤類型的抑癌基因，Liu等[16]通過非編碼RNA芯片發(fā)現(xiàn)，與惡性程度低的腔內(nèi)乳腺癌相比，惡性基底細(xì)胞樣乳腺癌中miRNA-375的表達(dá)水平明顯降低，且發(fā)現(xiàn)CPNE8作為miRNA-375的下游靶基因參與了乳腺癌的惡性進(jìn)程。與上述Ramsey和Bu等研究結(jié)果相一致的是，我們免疫組化結(jié)果表明，CPNE8在胃癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于胃癌旁組織；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CPNE8的表達(dá)水平與胃癌患者的TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示其可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。通過對根治性胃切除術(shù)后患者進(jìn)行隨訪調(diào)查，結(jié)果表明CPNE8高表達(dá)組患者的無病生存時間較CPNE8低表達(dá)患者明顯縮短；并且TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CPNE8蛋白表達(dá)是影響胃癌患者總生存時間的獨立危險因素，TNM分期和CPNE8蛋白表達(dá)是影響胃癌患者無病生存時間的獨立危險因素，提示CPNE8高表達(dá)的胃癌患者具有較差的預(yù)后。隨著早期胃癌患者可行胃鏡下胃黏膜切除手術(shù)的進(jìn)步與推廣，判斷早期胃癌患者是否有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移已成為行胃黏膜切除手術(shù)適應(yīng)癥的關(guān)鍵。因此，本研究結(jié)果將有助于CPNE8作為早期胃癌患者行胃黏膜切除手術(shù)的適應(yīng)癥的潛在指標(biāo)之一。

當(dāng)然，本研究僅限于分析CPNE8表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，對CPNE8如何參與胃癌進(jìn)展的具體調(diào)控機(jī)制未作進(jìn)一步的探討，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，CPNE8作為鈣離子依賴性膜結(jié)合蛋白主要通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)間接調(diào)控其靶蛋白的功能，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控作用。因此，我們后續(xù)將重點研究CPNE8相關(guān)靶蛋白對胃癌的增殖調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入探討。

綜上所述，本研究通過組織水平發(fā)現(xiàn)，CPNE8在胃癌中高表達(dá)預(yù)示患者不良的預(yù)后，提示其在胃癌的惡性進(jìn)展過程中扮演重要的角色，可成為胃癌早期診斷和預(yù)后評估潛在的分子標(biāo)志物。