閆 侯利芳 李任飛 閆鵬 王月東 鄭玉婷

肺癌發(fā)病率和死亡率均較高，居惡性腫瘤首位[1]，80%屬于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[2]。常規(guī)手術(shù)、放療和化療療效欠佳，五年存活率低[3]。靶向治療是最有希望治愈肺癌的手段[4]，目前常用的靶向藥物是小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)[5]，如吉非替尼、厄洛替尼和阿帕替尼等，其靶點(diǎn)是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，EGFR能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、血管生成和轉(zhuǎn)移[6]。盡管靶向藥物對(duì)EGFR突變的患者療效顯著[7]，但是會(huì)有60%以上的患者發(fā)生二次突變而產(chǎn)生耐藥[8]。因此，檢測(cè)EGFR是否突變是預(yù)測(cè)EGFR-TKI靶向治療療效的關(guān)鍵。直接基因測(cè)序是檢測(cè)EGFR突變的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，但是需要反復(fù)穿刺取材，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，所以限制了其臨床應(yīng)用。因此，迫切需要實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)及在體檢測(cè)EGFR突變情況指導(dǎo)臨床肺癌靶向治療。

分子影像能夠在體評(píng)估EGFR是否突變及靶向治療過(guò)程中EGFR再次發(fā)生突變。18F-PEG6-IPQA、11C-Erlotinib、11C-PD153035和11C-Geftinib等探針已合成并用于評(píng)估EGFR突變情況[10-11]。本研究先前合成PD153035的類似物MPG并成功合成探針99mTc-HYNIC-MPG。在此進(jìn)一步探討了99mTc-HYNIC-MPG探針活體SPECT分子成像。

1 材料和方法

1.1 合成99Tc-HYNIC-MPG探針

如文獻(xiàn)描述[12]，最優(yōu)條件合成，0.5 mL EDDA溶液(10 mg/mL)，10 μL HYNIC-MPG(3 mg/mL)，10 μL SnCl2(0.2 mg/mL)和Tricine 20 mg，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的情況下，100℃加熱10 min，然后用C18分離純化柱子純化。使用紙層析法測(cè)定放化標(biāo)記率。合成99Tc-HYNIC-MPG的放射化學(xué)純度為>98%。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

購(gòu)于ATCC的四種人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系：實(shí)驗(yàn)組PC9細(xì)胞系(EGFR 19外顯子E746-A750缺失)，對(duì)照組H1975細(xì)胞系(EGFR L858R/T790M雙突變)，對(duì)照組H358細(xì)胞系(EGFR野生型)和對(duì)照組H520細(xì)胞系(EGFR表達(dá)陰性)。細(xì)胞培養(yǎng)液為RPMI-1640和胎牛血清(9∶1比例)，其中PC9細(xì)胞系需要使用DMEM培養(yǎng)，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞傳代、復(fù)蘇及凍存的過(guò)程中嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，防止細(xì)胞污染。

1.3 細(xì)胞攝取、釋放和阻斷實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前12 h選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的四種細(xì)胞系12孔培養(yǎng)板鋪板，每孔加入5×105個(gè)細(xì)胞，每孔加入1.0 μL Ci99Tc-HYNIC-MPG探針后，放置37℃細(xì)胞孵育箱孵育。于15、30、60和120 min時(shí)間點(diǎn)去除液體，1 mL冷的PBS沖洗兩次，沖洗液使用γ-counter(PerkinElmer 2480)每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)為Cout，然后加入200 μL 0.1N的NAOH，使用200 μL冷PBS溶液沖洗兩次，液體保留，γ-counter計(jì)數(shù)Cin，細(xì)胞攝取計(jì)算公式=Cin/(Cin+Cout)。同理，細(xì)胞加入99Tc-HYNIC-MPG探針?lè)跤? h后行細(xì)胞釋放實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前1 h在PC9細(xì)胞中加入PD153035(100 μM)，剩余步驟與攝取和釋放實(shí)驗(yàn)一致。

1.4 建立荷瘤鼠模型

使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用裸鼠，購(gòu)于國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心，雌性BALB/c裸鼠48只體重(20.0±0.5)g，年齡為6周(動(dòng)物系)，所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，有專業(yè)人員提供喂養(yǎng)和保潔，有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作流程。建立四種細(xì)胞系荷瘤鼠模型，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)5×106個(gè)細(xì)胞，使用1 mL胰島素注射器抽吸細(xì)胞懸液注入裸鼠右肩。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，體積公式=(長(zhǎng)徑×短徑2)/2，待體積達(dá)到200 mm3時(shí)可行實(shí)驗(yàn)。

1.5 SPECT掃描

使用臨床SPECT掃描儀。四組荷瘤裸鼠均經(jīng)尾靜脈注射7.4MBq(100 μL含200 μCi)探針99Tc-HYNIC-MPG，使用小動(dòng)物麻醉機(jī)2%異氟烷麻醉(每組3～4只荷瘤鼠)，于1 h、2 h、4 h和6 h時(shí)間點(diǎn)成像。成像條件：變焦倍數(shù)為1，靜態(tài)成像5 min，數(shù)據(jù)儲(chǔ)存為1 024×1 024，能量窗口為126～154 keV，核素為99Tc。阻斷實(shí)驗(yàn)是在SPECT成像前1 h荷PC9腫瘤鼠模型尾靜脈注射100 mg/kg的PD153035，其余步驟如前，在感興趣區(qū)域計(jì)算出腫瘤/肌肉比值。

1.6 生物分布實(shí)驗(yàn)

SPECT成像后，處死實(shí)驗(yàn)裸鼠，立即采集大腦、心臟、肺、肝、腫瘤、骨、腎、胃、腸、血、脾、皮膚和肌肉等組織。伽瑪計(jì)數(shù)器(PerkinElmer)測(cè)量樣品放射性計(jì)數(shù)以及測(cè)量樣品濕重，在校正了所有測(cè)量值的衰減后，放射性以注射劑量的百分比表示每克(% ID/g)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的分析采用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞攝取、釋放和阻斷試驗(yàn)

PC9細(xì)胞系對(duì)99mTc-HYNIC-MPG的攝取明顯高于H358、H520和H1975三種細(xì)胞系。在2 h時(shí)，PC9細(xì)胞中探針攝取率達(dá)到最高水平(22.73±0.63)%，明顯高于H1975細(xì)胞攝取率(6.14±0.43)%(P=0.002)，H358細(xì)胞攝取率(3.39±0.37)%(P=0.0007)和H520細(xì)胞攝取率(4.17±0.25)%(P=0.0009)(圖1A)。在細(xì)胞釋放實(shí)驗(yàn)中，PC9細(xì)胞2 h時(shí)探針攝取率為(6.16±0.28)%，高于H1975(2.03±0.61%，P=0.04)，H358(1.23±0.30%，P=0.03)和H520(1.63±0.05%，P=0.04)H1975、H358和H520細(xì)胞(圖1B)。而且，PC9細(xì)胞對(duì)99mTc-HYNIC-MPG的高攝取可被100 μM的PD153035阻斷，其吸收比從(22.73±0.63)%下降到(1.90±0.06)%(P<0.0001)，而且釋放實(shí)驗(yàn)也能證實(shí)PD153035的阻斷作用(圖1C-D)。

2.2 SPECT成像

PC9細(xì)胞系荷瘤鼠的腫瘤對(duì)99mTc-HYNIC-MPG探針攝取率高而且在所有時(shí)間點(diǎn)上都比另外三種細(xì)胞系荷瘤鼠的腫瘤對(duì)探針攝取率要高。在6 h的時(shí)間點(diǎn)上PC9組T/M比值(5.47±0.37)高于H1975組(2.45±0.32，P=0.025)、H358組(2.35±0.40，P=0.019)和H520組(1.72±0.28，P=0.008)(圖2)。PC9動(dòng)物模型對(duì)99mTc-HYNIC-MPG攝取被100 mg/kg的PD153035阻斷，T/M比降至2.51±0.30(P=0.009)(圖3)，說(shuō)明99mTc-HYNIC-MPG探針只靶向19外顯子缺失的EGFR突變。

圖2 四種不同細(xì)胞系動(dòng)物模型對(duì)99mTc-HYNIC-MPG探針的攝取情況Figure 2 The imaging of 99mTc-HYNIC-MPG probes taken in xenografts from PC9，H1975，H358 and H520 cells in BABL/c nude miceNote：Xenografts from PC9 cells were obvious more uptaken 99mTc-HYNIC-MPG probes in nude mice.Arrows for different tumor cell lines.

圖3 PC9動(dòng)物模型的在體阻斷實(shí)驗(yàn)Figure 3 The imaging of blocking 99mTc-HYNIC-MPG in xenografts from PC9 cells in BABL/c nude miceNote：A.The imaging of 99mTc-HYNIC-MPG uptake in xenografts from PC9 cells；B.The imaging of blocked uptaken 99mTc-HYNIC-MPG by injected PD153035(100 mg/kg).Arrows show xenografts.**P<0.01，when compared with before treatment.

圖1 細(xì)胞攝取、釋放及阻斷實(shí)驗(yàn)Figure 1 The cellular uptake，efflux and blocking 99mTc-HYNIC-MPG in H358，H520，H1975 and PC9 cellsNote：A.The highest cellular uptake ratio of 99mTc-HYNIC-MPG was in EGFR-mutated PC9 cells(22.73±0.63)%，following H1975 cells，H358 cells and H520 cells.**P<0.01，when compared with the PC9 group；B.The cellular efflux of 99mTc-HYNIC-MPG in H358，H520，H1975 and PC9 cells. **P<0.05，when compared with the PC9 group；C.The cellular uptake of 99mTc-HYNIC-MPG after mutated EGFR binding to 99mTc-HYNIC-MPG was blocked with PD153035(100 μmol/L)in PC9 cells.**P<0.001，when compared with the PC9-MPG group；D.The cellular efflux of 99mTc-HYNIC-MPG after blocking in PC9 cells，**P<0.01，when compared with the PC9-MPG group.

2.3 生物分布實(shí)驗(yàn)

99mTc-HYNIC-MPG探針成像后，生物分布實(shí)驗(yàn)證實(shí)2 h時(shí)PC9腫瘤對(duì)99mTc-HYNIC-MPG探針攝取率為(7.20±0.27)%ID/g，高于H1975(2.35±0.03%ID/g，P=0.008)、H358(2.47±0.01%ID/g，P=0.009)和H520(1.93±0.01%ID/g，P=0.007)(圖4A)。生物分布實(shí)驗(yàn)證實(shí)PC9荷瘤鼠模型對(duì)99mTc-HYNIC-MPG探針的特異性。100 mg/kg PD153035阻斷時(shí)，PC9攝取從(7.20±0.27)% ID/g下降至(2.67±0.27)% ID/g，P=0.009)(圖4B)。這一結(jié)果與SPECT成像一致。所有荷瘤鼠大腦的攝取均很低，表明99mTc-HYNIC-MPG不能通過(guò)血腦屏障。

圖4 四種細(xì)胞系荷瘤鼠的生物分布實(shí)驗(yàn)及阻斷實(shí)驗(yàn)Figure 4 The biological distribution and blocking 99mTc-HYNIC-MPG in xenografts from PC9，H1975，H358 and H520 cells in BABL/c nude miceNote：A.The biological distribution of 99mTc-HYNIC-MPG in main organs was observed at 2 h time point，the uptake of 99mTc-HYNIC-MPG in xenografts from PC9 cells reached(7.20±0.27)% ID/g 2 h through the injection of tail vein.**P<0.01，when compared with the PC9 groups；B.The blocking 99mTc-HYNIC-MPG probes by injected PD153035(100 mg/kg).**P<0.01，when compared with the before treatment.

3 討論

精準(zhǔn)判定腫瘤中EGFR突變情況可以準(zhǔn)確選擇靶向治療的患者，同時(shí)可以設(shè)計(jì)更有效的治療方案。這就需要檢測(cè)患者腫瘤內(nèi)EGFR突變狀態(tài)，其金標(biāo)準(zhǔn)是熒光原位雜交和免疫組織化學(xué)分析[13]。然而，其具有巨大局限性：首先，穿刺活檢取材分析EGFR不能反映腫瘤整體的異質(zhì)性[14]。二是反復(fù)穿刺活檢會(huì)造成患者心理和生理上的傷害[15]。相比之下，分子成像能夠在體、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)EGFR突變情況并克服了上述局限性。大量分子探針研究用于監(jiān)測(cè)EGFR突變情況，如18F-geftinib、11C-PD153035和11C-geftinib[16-17]，但是18F和11C的半衰期分別是110 min和20.34 min，半衰期短，而且需要加速器合成，此外上述探針合成條件復(fù)雜，昂貴，限制了臨床的廣泛應(yīng)用[18]，大多數(shù)上述示蹤劑親脂性太強(qiáng)而不能迅速?gòu)捏w內(nèi)清除。99mTc半衰期6.02 h，能量1400 kev，可以通過(guò)鉬锝發(fā)生器即可獲得，各地二級(jí)臨床醫(yī)院均可使用。

于金明院士的研究證明PD153035能夠特異性結(jié)合19外顯子缺失EGFR突變(PC9細(xì)胞系)。PD153035的分子成像研究主要是通過(guò)18F或者11C標(biāo)記[19]，而且PD153035水溶性較差，細(xì)胞毒性高，不適合臨床推廣應(yīng)用。我們根據(jù)喹唑啉衍生物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并合成了MPG，在該分子中，PEG官能團(tuán)在7位連接至喹唑啉環(huán)以增加親水性。99Tc-HYNIC-MPG可以通過(guò)一步合成法輕松制備。本研究使用四種細(xì)胞系H358(EGFR野生型)、H520(EGFR陰性)、H1975(EGFR T790M/L858R二次突變)和PC9(EGFR 19 E746-A750)，PC9細(xì)胞系是EGFR 19 E746-A750缺失，能夠指導(dǎo)特異性蛋白表達(dá)，從而改變空間構(gòu)象，能夠特異的與MPG和PD153035結(jié)合，而其他三種細(xì)胞系無(wú)此特異性蛋白的表達(dá)，因此不能與探針特異性結(jié)合。體外實(shí)驗(yàn)表明，PC9細(xì)胞系與EGFR陰性或EGFR野生型細(xì)胞相比，99Tc-HYNIC-MPG積聚明顯更高，并且PD153035可以阻斷PC9細(xì)胞系對(duì)探針的攝取。PC9細(xì)胞系構(gòu)建的腫瘤最高攝取為(7.20±0.27)%ID/g，但是肝臟對(duì)99Tc-HYNIC-MPG探針的攝取也高，是由于小分子酪氨酸激酶藥物主要是通過(guò)肝臟代謝的，此外腎臟也代謝一部分，尿液中的探針含量也很高。99Tc-HYNIC-MPG不能通過(guò)血腦屏障能夠?qū)δX部組織起到很好的保護(hù)作用。具體的99Tc-HYNIC-MPG探針與EGFR 19 E746-A750缺失蛋白相結(jié)合的分子機(jī)制和分子線路圖尚不清楚仍需進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)研究仍有一些不足之處，鉬锝發(fā)生器生產(chǎn)99mTc，溶液中會(huì)有一些99Mo以及其他核素，放射純度沒(méi)有達(dá)到理想的豐度。使用99mTc標(biāo)記探針時(shí)肝臟由于有Kupffer細(xì)胞等吞噬系統(tǒng)能夠?qū)⒂坞x的放射性核素吞噬到肝臟，增加肝臟的放射性劑量和背景噪聲。同時(shí)99mTc-HYNIC-MPG合成后應(yīng)進(jìn)一步純化，分離出未被標(biāo)記的MPG，這樣就能避免未標(biāo)記的MPG搶占突變EGFR的ATP結(jié)合域，從而降低PC9細(xì)胞系腫瘤對(duì)99mTc-HYNIC-MPG探針的攝取，尤其是細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)因其所需劑量甚小，所以影響更大。從本質(zhì)上講SPECT是一種定性的成像設(shè)備，只能半定量進(jìn)行研究，因此99mTc-HYNIC-MPG探針活體成像能夠?qū)Τ上駝?dòng)物的具體器官如肝臟、肺臟及腫瘤等進(jìn)行定量化分析，只能通過(guò)生物分布實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，但其不能完全準(zhǔn)確的反映活體的動(dòng)態(tài)信息。在本研究的基礎(chǔ)上，將使用PET/CT成像進(jìn)一步研究MPG的相關(guān)性質(zhì)。最后，小型動(dòng)物SPECT成像儀器設(shè)備可以明顯提高圖像質(zhì)量。

綜上所述，99Tc-HYNIC-MPG探針SPECT成像能夠特異性識(shí)別EGFR外顯子19缺失突變，可用于篩選EGFR是否發(fā)生突變，是否適合靶向治療，及有望用于監(jiān)測(cè)臨床靶向治療的療效，臨床應(yīng)用前景廣闊。