汪斌如 張瑩瑩 楊麗萍 劉莉 陳始明 梁耕田

聲帶固有層主要由細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)組成，其組織結(jié)構(gòu)決定了聲帶的振動特性和粘膜波功能，是正常發(fā)聲的基礎(chǔ)[1，2]。正常情況下，ECM的合成和降解處于動態(tài)平衡，以維持聲帶的發(fā)聲功能；在手術(shù)、感染、外傷等病理情況下，ECM的動態(tài)平衡受到破壞，就會出現(xiàn)聲帶瘢痕而引起永久性聲嘶甚至失聲[3，4]。目前有關(guān)聲帶損傷后ECM中相關(guān)因子表達(dá)致聲帶瘢痕的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其可能是聲帶瘢痕形成和難以治愈的原因之一[2～4]。前期研究顯示，犬聲帶損傷后12 w時(shí)聲帶固有層ECM膠原纖維過度無序增生和彈性纖維減少，出現(xiàn)了聲帶瘢痕[5]。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)在ECM的合成和傷口愈合中發(fā)揮重要作用[6～8]，其中，LOX參與ECM膠原蛋白和彈性蛋白的翻譯后修飾過程，MMPs參與ECM各種蛋白的降解、血管形成，MMPs的異常表達(dá)是組織損傷后不能自我修復(fù)的重要原因；HIF-1α參與了組織損傷后的蛋白合成和微血管形成等過程。有關(guān)研究顯示，調(diào)節(jié)LOX基因和MMP基因的表達(dá)對韌帶和心肌損傷修復(fù)具有重要的影響[9～11]。目前有關(guān)LOX、MMPs和HIF-1α在聲帶修復(fù)中的研究較少，推測LOX、MMP-1可能在聲帶損傷后創(chuàng)面自身愈合及瘢痕形成中發(fā)揮著不同的作用。故本研究擬采用CO2激光切除犬雙側(cè)聲帶，觀察術(shù)前和術(shù)后不同時(shí)間段聲帶形態(tài)學(xué)、ECM中LOX、MMP-1和HIF-1α在聲帶創(chuàng)面愈合過程中的動態(tài)表達(dá)特點(diǎn)，探討聲帶損傷后的修復(fù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 5只健康成年雄性中華田園犬(湖北省瑞科森試驗(yàn)動物有限公司提供，體重12～15 kg)，數(shù)字表法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(4只，8側(cè)聲帶)和對照組(1只，2側(cè)聲帶)。實(shí)驗(yàn)組分別行支撐喉鏡下CO2激光雙側(cè)聲帶切除術(shù)，于術(shù)后6 h、3 w、8 w和12 w分別處死1只犬于聲帶取材，對照組不做特殊處理。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合武漢市第三醫(yī)院動物倫理委員會要求。

1.2主要器材及試劑 Lumenis型貝多芬智能CO2激光(美國科醫(yī)人)，IX51型倒置顯微鏡和CX-21型普通光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS)，顯微喉鉗、支撐喉鏡、高清喉內(nèi)窺鏡及視頻記錄系統(tǒng)、冷光源、0°內(nèi)窺鏡鏡頭(德國karl Storz)，anti-LOX抗體，anti-MMP-1抗體和anti-HIF-1α抗體(北京Bioss)。

1.3CO2激光犬聲帶全切除術(shù) 實(shí)驗(yàn)組動物術(shù)前禁食12 h，稱重，左后肢肌肉注射麻醉(速眠新0.1 mg/kg+戊巴比妥鈉0.8 mg/kg)，在支撐喉鏡下暴露雙側(cè)聲帶，應(yīng)用CO2激光6焦耳/秒行雙側(cè)聲帶全切除深達(dá)肌層，清除創(chuàng)面碳化組織，充分止血。術(shù)后軟食，1 w后改正常飲食。對照組在支撐喉鏡下觀察聲帶形態(tài)后不作任何處理，清醒后正常進(jìn)食。

1.4犬聲帶形態(tài)學(xué)觀察 對照組和實(shí)驗(yàn)組犬分別于術(shù)前及術(shù)后6 h、3 w、8 w和12 w肌肉注射麻醉(方法同上)后，于支撐喉鏡下觀察聲帶創(chuàng)面愈合情況，并于各時(shí)間點(diǎn)取一只犬實(shí)施安樂死，雙側(cè)聲帶多點(diǎn)取材進(jìn)行HE染色和免疫熒光染色檢查。

1.5HE染色 聲帶標(biāo)本用4%甲醛固定，石蠟包埋切片，片厚4 μm，HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察聲帶各層炎癥反應(yīng)、纖維結(jié)構(gòu)變化以及瘢痕形成情況。

1.6免疫熒光染色 聲帶標(biāo)本石蠟切片，烘片脫蠟。PBS沖洗3次。EDTA緩沖液微波修復(fù)。PBS洗3次各5 min，甩干，5% BSA封閉20 min。去除BSA液，每張切片加50 μl一抗，覆蓋組織，4 ℃過夜。PBS洗三次，各5 min，加二抗，37 ℃孵育50 min；PBS 洗三次，各5 min；防淬滅劑封片。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取1張切片，每張片任選2～3個(gè)視野，視野面積為0.51 mm×0.40 mm。熒光顯微鏡下觀察聲帶LOX、MMP-1和HIF-1α蛋白表達(dá)部位和量，以及聲帶瘢痕的形成情況。高倍鏡(×400)下取3個(gè)不重疊視野，矯正光密度后對各組圖像選色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析系統(tǒng)測量圖像共定位區(qū)域累積光密度值(integrated optical density index, IOD值)，反映共定位區(qū)域面積和熒光強(qiáng)度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以IBM SPSS Statistics 22.0行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，圖像采集的IOD值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布并經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，多組間比較用One-Way ANOVA中的LSD或Dunnett檢驗(yàn)，采用Pearson進(jìn)行相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1對照組及實(shí)驗(yàn)組犬聲帶形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 支撐喉鏡下犬正常聲帶表面呈白色,可見血管紋,粘膜光滑，聲門閉合及發(fā)音功能良好(圖1a)；CO2激光切除犬雙側(cè)聲帶至肌層(圖1b，術(shù)后6 h)；術(shù)后3 w聲帶創(chuàng)面見較明顯的充血水腫及炎性分泌物(圖1c)；術(shù)后8 w雙側(cè)聲帶充血水腫試驗(yàn),聲帶局部凹陷(圖1d)；術(shù)后12 w雙側(cè)聲帶充血水腫消失，表面光滑，無粘連和肉芽，聲帶局部攣縮，雙側(cè)聲帶閉合不全，聲嘶明顯(圖1e)。

2.2犬聲帶組織HE染色結(jié)果 術(shù)前聲帶分層清晰，由被覆復(fù)層鱗狀上皮層、結(jié)締組織層、肌層構(gòu)成(圖2a)；術(shù)后6 h，聲帶創(chuàng)面大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞充血水腫明顯(圖2b)；術(shù)后3 w，聲帶創(chuàng)面上皮下固有層仍有炎癥細(xì)胞浸潤，新生微血管形成，成纖維細(xì)胞增生，無序排列，間質(zhì)水腫(圖2c)；術(shù)后8 w，聲帶創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤減少，無明顯紅細(xì)胞滲出，血管增粗，各層纖維組織增生，呈束狀或團(tuán)狀紊亂排列(圖2d)；術(shù)后12 w，聲帶上皮層大部分缺失，復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞層數(shù)增多；固有層血管或腺體減少或消失，腺體內(nèi)有黏蛋白積聚；固有層膠原纖維增厚、增多，纖維組織團(tuán)狀或束狀紊亂排列，較多不規(guī)則纖維裂隙；肌層可見散在紊亂的膠原纖維束(圖2e)。

2.3免疫熒光染色結(jié)果

2.3.1ECM相關(guān)因子陽性細(xì)胞表達(dá) 由圖3可見，LOX、MMP-1和HIF-1α均定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，術(shù)前(對照組)和術(shù)后(實(shí)驗(yàn)組)聲帶均呈程度不一的陽性反應(yīng)。術(shù)前陽性細(xì)胞主要位于固有層全層，淺層含量略多。術(shù)后6 h和3 w，雙側(cè)聲帶創(chuàng)面上皮細(xì)胞和纖維層的炎性細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腺體內(nèi)陽性細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)烈；術(shù)后8 w和12 w，雙側(cè)聲帶創(chuàng)面陽性細(xì)胞逐漸減少，恢復(fù)至術(shù)前水平。

2.3.2IOD值分析 術(shù)前及術(shù)后6 h、3 w、8 w和12 w各因子IOD值見表1，可見各時(shí)間點(diǎn)LOX、MMP-1比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；除術(shù)后12 w與術(shù)前比較外，其余各時(shí)間點(diǎn)HIF-1α比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各相關(guān)因子在犬聲帶損傷不同時(shí)間段免疫熒光IOD值比較

3 討論

徐文等[12]報(bào)道聲帶損傷后3個(gè)月聲帶瘢痕基本形成。本研究實(shí)驗(yàn)組犬CO2激光聲帶全切除后支撐喉鏡下顯示，CO2激光手術(shù)創(chuàng)面位于雙側(cè)聲帶，深達(dá)肌層，術(shù)后3 w，聲帶創(chuàng)面仍有充血水腫，術(shù)后8 w聲帶創(chuàng)面充血水腫減輕，表面凹陷，術(shù)后12 w聲帶創(chuàng)面不規(guī)則瘢痕基本形成。組織學(xué)觀察顯示聲帶損傷早期(術(shù)后3 w)，創(chuàng)面較多炎性滲出，間質(zhì)充血水腫，新生血管形成；損傷中期(術(shù)后8 w)，創(chuàng)面炎癥反應(yīng)明顯減少，纖維組織增生明顯；損傷后期(術(shù)后12 w)，創(chuàng)面纖維組織大量增生，呈團(tuán)狀或束狀排列紊亂，較多不規(guī)則間隙，排列結(jié)構(gòu)紊亂，提示聲帶瘢痕形成。

LOX促進(jìn)ECM膠原和彈性蛋白的翻譯后修飾過程，同時(shí)維持ECM內(nèi)環(huán)境免受金屬蛋白酶的降解，在ECM的生長、重塑、穩(wěn)定和傷口愈合中發(fā)揮重要作用[5,6]；LOX過表達(dá)時(shí)，引起ECM的過度交聯(lián)，引發(fā)不可逆的漸進(jìn)性的組織纖維化。MMPs是膠原和彈性纖維降解的主要蛋白酶，參與ECM的降解、促進(jìn)新生血管的形成、調(diào)節(jié)細(xì)胞間粘附等；MMP-1由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅹ型膠原并促進(jìn)新生血管形成[7,10]。本研究結(jié)果顯示，LOX、MMP-1和HIF-1α定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，大多在炎性細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞和腺體內(nèi)表達(dá)較強(qiáng)烈。聲帶損傷早期(術(shù)后6 h)LOX表達(dá)稍有下降，此后其合成不斷增加，損傷中后期(術(shù)后3～12 w)時(shí)仍維持較高水平；MMP-1在聲帶損傷早期(術(shù)后6 h)表達(dá)較術(shù)前下降，聲帶損傷中期(術(shù)后3 w)升高達(dá)最高值，至聲帶損傷后期(術(shù)后12 w)達(dá)較低水平，這與部分學(xué)者報(bào)道前交叉韌帶損傷后成纖維細(xì)胞中LOX基因表達(dá)上升、MMP-1主要基因表達(dá)下降的結(jié)果一致[11，13]。即MMP-1主要在聲帶瘢痕形成早期發(fā)揮作用，而LOX主要在聲帶瘢痕形成中后期發(fā)揮作用，但MMP-1在聲帶瘢痕形成全程中的表達(dá)量明顯少于LOX，不足以對抗LOX的纖維化作用。低氧環(huán)境是瘢痕形成的重要因素，聲帶創(chuàng)傷早期，組織缺氧會影響成纖維細(xì)胞的活性，膠原的合成與降解、生長因子的分泌。HIF-1α是缺氧的特異感受因子，通過協(xié)助蛋白合成、血管再生促進(jìn)創(chuàng)面愈合。文中結(jié)果顯示，聲帶損傷早期(術(shù)后6 h)，HIF-1α迅速增加至峰值，中后期(術(shù)后3～12 w)逐漸恢復(fù)至正常水平；HIF-1α在術(shù)后12 w和術(shù)前相比未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明HIF-1α主要在聲帶損傷早中期(8 w內(nèi))發(fā)揮作用。需要指出的是，由于IOD值僅間接反映陽性目標(biāo)總的表達(dá)強(qiáng)度，加之本研究觀察標(biāo)本數(shù)量較少，損傷的程度和個(gè)體愈合的機(jī)制可能有所不同[14]，這些因素均可能導(dǎo)致上述結(jié)果存在一定的誤差。

較多學(xué)者認(rèn)為聲帶術(shù)后15 d內(nèi)處于極度活躍增生狀態(tài)，3個(gè)月后瘢痕組織趨于穩(wěn)定[1,15]。文中結(jié)果顯示術(shù)后6 h、3 w和8 w LOX、MMP-1和HIF-1α表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即LOX、MMP-1和HIF-1α在術(shù)后早中期(<8 w)表達(dá)較活躍，至術(shù)后12 w時(shí)隨著創(chuàng)面基本愈合其表達(dá)也趨于穩(wěn)定。LOX、MMP-1在術(shù)前和術(shù)后不同時(shí)間段表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，尤其是術(shù)后12 w時(shí)仍未回復(fù)至術(shù)前水平，說明術(shù)后12 w時(shí)LOX、MMP-1仍處于較高表達(dá)狀態(tài)，聲帶瘢痕仍未完全穩(wěn)定，也間接證實(shí)了部分學(xué)者報(bào)道的聲帶損傷后6～12個(gè)月時(shí)聲帶瘢痕中纖維蛋白表達(dá)量較術(shù)前仍有增加[12,16]。

綜上所述，正常聲帶ECM中LOX、MMP-1和HIF-1α的表達(dá)很低，在創(chuàng)傷時(shí)，聲帶組織發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，由成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞合成的MMP-1增加，促進(jìn)ECM中各種膠原降解、細(xì)胞黏附[5,7]，HIF-1α等物質(zhì)合成增加也會直接或間接參與微血管形成[8]。但由于MMP-1和HIF-1α在聲帶損傷早中期表達(dá)量較少，發(fā)揮的作用有限，對聲帶瘢痕的預(yù)防和治療效果尚不明顯。在聲帶損傷中后期，LOX過度表達(dá)，參與ECM纖維蛋白的翻譯后修飾過程，導(dǎo)致大量的膠原纖維過度分泌和無序沉積，以及彈性纖維減少，促進(jìn)了聲帶瘢痕形成[9，14，17]。故探討靶向促進(jìn)MMP-1和HIF-1α的表達(dá)，同時(shí)靶向抑制LOX的合成，可能為聲帶瘢痕的防治提供新的研究思路[9～11]。