王小玲,馬 琨,伏云珍,安嫄嫄,汪志琴,

1 寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,銀川 750021 2 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021 3 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085

免耕是指不翻耕和擾動(dòng)土壤,把作物直接播種到種床上,將前茬作物殘茬或草皮等覆蓋地表,僅播種一次田間作業(yè)的農(nóng)作制度[1]?？梢詼p少水土流失,穩(wěn)定土壤結(jié)構(gòu)[2-3],形成合理的土壤水、氣、熱三相比；在改善土壤微生態(tài)環(huán)境,促進(jìn)土壤養(yǎng)分良性循環(huán)中起主要貢獻(xiàn)[4]。

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,能夠參與土壤養(yǎng)分循環(huán),分解等過(guò)程,對(duì)溫室氣體產(chǎn)生和環(huán)境污染物凈化起著重要作用[5]。近年來(lái),大量研究證實(shí),土壤微生物的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)及多樣性是維持土壤健康和質(zhì)量的重要因素[6]。因此,研究不同耕作措施下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律,對(duì)選擇合理的種植措施和改善土壤生態(tài)功能具有重要意義。

目前關(guān)于不同農(nóng)業(yè)管理措施下,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化的研究結(jié)果仍存在差異[1,3]。如長(zhǎng)期免耕或綠肥翻壓會(huì)增加土壤微生物數(shù)量,影響其多樣性[7]；保護(hù)性耕作施生物有機(jī)肥也能夠提高土壤細(xì)菌多樣性和生物量[8]。但,傳統(tǒng)耕作施化肥和有機(jī)肥卻對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響較小[9]。Yang等[10]研究結(jié)果顯示,免耕和秸稈還田能夠增加土壤有機(jī)碳含量,調(diào)控土壤微生物生長(zhǎng)及群落結(jié)構(gòu)多樣性,在提升土壤肥力和生產(chǎn)力方面有重要作用。

然而,以往研究更多關(guān)注的是耕作方式及施肥種類的差異對(duì)土壤生物生物量、酶活性和微生物呼吸作用等方面的影響,而同時(shí)采用免耕、覆蓋和生物有機(jī)肥施用等栽培管理措施對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響的研究鮮有報(bào)道。因此,本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)寧夏南部山區(qū)冬小麥連續(xù)3年免耕體系下土壤細(xì)菌群落群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性分布特征進(jìn)行系統(tǒng)分析,探討不同處理措施下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異,明確耕作、覆蓋與施肥方式的交互作用是如何影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性？為制定合理的農(nóng)作制度提供理論支撐。

1 研究區(qū)域和方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于寧夏固原市隆德縣沙塘鎮(zhèn)(35°21′ N,105°48′ E),如圖1所示：地處寧夏南部邊陲,六盤山脈以西,屬于黃土高原丘陵區(qū)。氣候類型為中溫帶季風(fēng)區(qū)半濕潤(rùn)向半干旱過(guò)渡性氣候,年均氣溫6 ℃,年均降水量410 mm,年均蒸發(fā)量1370 mm。海拔1720—2942 m,地勢(shì)東高西低,土壤質(zhì)地主要以黑壚土為主。試驗(yàn)前土壤基本理化性狀：有機(jī)質(zhì)10.63 g/kg,全氮0.52 g/kg,堿解氮41.0 mg/kg,全磷0.65 g/kg,速效磷45.5 mg/kg,速效鉀170.5 mg/kg,pH 9.0。

圖1 研究區(qū)地理位置Fig.1 Location of the research area

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2015年春季開(kāi)始,采用雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。A因素為耕作方式：分為免耕覆蓋(N)、傳統(tǒng)耕作不覆蓋(T)2個(gè)水平；B因素為施肥方式：分為施生物有機(jī)肥(F)和不施生物有機(jī)肥(C),共4個(gè)處理,即免耕覆蓋+施生物有機(jī)肥(NF)、免耕覆蓋+不施生物有機(jī)肥(NC)、傳統(tǒng)耕作不覆蓋+施生物有機(jī)肥(TF)和傳統(tǒng)耕作不覆蓋+不施生物有機(jī)肥(TC),每個(gè)處理4次重復(fù),小區(qū)面積3 m×4 m,共16個(gè)小區(qū)。于2015年—2018年9月種植冬麥(Triticumaestivum)‘藍(lán)天32號(hào)’。前茬作物為蠶豆(ViciafabaL)‘臨蠶6號(hào)’。2015年冬小麥種植前將蠶豆秸稈粉碎與3000 kg/hm2脫粒的小麥穎殼均勻覆蓋于免耕處理土壤表面,后續(xù)試驗(yàn)不再覆蓋任何材料。冬小麥播種量為375 kg/hm2,每小區(qū)播種12行。施肥處理的小區(qū)僅施生物有機(jī)肥(黃腐酸≥12%,有機(jī)質(zhì)≥40%,巨大芽孢桿菌+膠凍樣類芽孢桿菌≥0.5億/g,凈含量40 kg/袋),施用量折合純氮(N%)90 kg/hm2,純磷(P2O5%)為19.67 kg/hm2、純鉀(K2O%)為18.58 kg/hm2。NF處理的小區(qū),生物有機(jī)肥隨冬小麥種子條施于播種溝內(nèi),TF處理隨播前耕翻施入土壤。在返青期,將前者的田間雜草齊地表割掉,覆蓋在冬小麥行間；后者雜草連根拔除,扔出田外。

1.3 樣品采集

2018年7月在試驗(yàn)區(qū)采樣,按照“S”形隨機(jī)多點(diǎn)混合取樣,采集耕層0—20 cm土壤樣品,每個(gè)小區(qū)隨機(jī)采集5個(gè)樣點(diǎn)混勻?yàn)?份,共獲得16份樣品。樣品采集后去除新鮮土樣中可見(jiàn)植物殘?bào)w及土壤動(dòng)物,按四分法取1 kg土樣放入采樣袋中,冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分自然風(fēng)干后用于測(cè)定土壤養(yǎng)分；另一部分保存在-80冰箱,用于土壤細(xì)菌多樣性測(cè)定。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤含水量采用烘干法,土壤pH值采用PHSJ-4F pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測(cè)定(土水比1:5)；土壤全碳(TC)和總氮(TN)采用碳氮分析儀(Elementar Vario MAX)測(cè)定；土壤微生物生物量碳(SMBC)采用氯仿熏蒸—0.5 mol/L K2SO4提取；土壤全磷(TP)和速效磷(AP)采用鉬銻抗比色法；堿解氮(AN)采用堿解擴(kuò)散法；速效鉀(AK)采用NH4OAc浸提-火焰光度法[11]。

1.4.2DNA提取和高通量測(cè)序

采用Fast DNA SPIN kits試劑盒(MP Biomedicals,USA),按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行土壤微生物總DNA提取,提取后使用Nanodrop 2000進(jìn)行DNA濃度和純度的測(cè)定,并用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。最后利用細(xì)菌16S rDNA基因的V3+V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。采用50 μl擴(kuò)增體系,反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃ 預(yù)變性2 min,98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃ 延長(zhǎng)30 s,72 ℃終延伸5 min,10 ℃持續(xù)25—30個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后,引入Illumina MiSeq 橋式PCR兼容引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,使用PicoGreen dsDNA Kit 分析試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)對(duì)回收的DNA精確定量[12],最后將PCR產(chǎn)物委托上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq 測(cè)序。

1.4.3統(tǒng)計(jì)分析

高通量測(cè)序數(shù)據(jù)利用QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, v1.8.)和R(v3.2.0)軟件,調(diào)用USEARCH序列比對(duì)工具,對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按97%相似度水平的OTUs(Operational Taxonomic Units)進(jìn)行分類學(xué)分析。采用Mothur軟件對(duì)全部有效序列進(jìn)行OTU聚類統(tǒng)計(jì),繪制韋恩圖(Venn圖)。根據(jù)物種分類信息繪制物種豐度熱圖。利用Mothur軟件[13-14]計(jì)算多樣性指數(shù)(Simpson、Shannon、Chao1和ACE)。通過(guò)UniFrac軟件進(jìn)行NMDS分析,繪制樣本聚類樹(shù)[15]。采用DPS(7.05)軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)、作物產(chǎn)量等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(Duncan′s法多重比較法,顯著水平設(shè)為0.05)。土壤微生物主成分分析(PCA)在多元統(tǒng)計(jì)分析軟件Canoco 5.0中進(jìn)行。Origin 8.0繪制降雨量點(diǎn)線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

不同處理土壤理化性質(zhì)如表1所示。土壤含水量、速效鉀、堿解氮、總碳和總氮含量整體表現(xiàn)為免耕覆蓋處理明顯高于傳統(tǒng)耕作處理,而土壤pH、C/N比則表現(xiàn)為傳統(tǒng)耕作處理顯著高于免耕處理。方差統(tǒng)計(jì)分析顯示,與不施用生物有機(jī)肥處理相比,施用生物有機(jī)肥影響了不同處理間的土壤理化性質(zhì),但差異不顯著；而耕作措施卻顯著改變了不同處理間土壤pH、C/N比、全氮含量(F=6.565,P=0.031*；F= 49.391,P=0.0001**；F=19.871,P=0.002**)。同時(shí),不施用生物有機(jī)肥時(shí),土壤pH、AP、C/N 比和SMBC 表現(xiàn)為TC>NC,其余土壤理化性狀在各處理間均呈現(xiàn)NC>TC,其中SMBC和TN含量分別增加了94.04%和15.38%。施用生物有機(jī)肥時(shí),SMBC、AP、AN、TC和TN含量均呈現(xiàn)NF>TF；尤以SMBC和AP含量增加幅度最大,分別為114.74%和21.87%；而C/N比和AK的含量與之相反,分別降低了5.60%和7.04%。

表1 不同處理土壤理化及生物學(xué)性狀分析Table 1 Analysis of physical and chemical and biological characteristics of soil under different treatments

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性及測(cè)序數(shù)據(jù)分析

通過(guò)對(duì)土壤DNA基因組序列分析發(fā)現(xiàn)(表2),4種處理總共獲得785688條有效序列,其中TC、TF、NC和NF處理分別獲得細(xì)菌16S rRNA的平均序列數(shù)48607、48101、52687、47028條。對(duì)測(cè)序獲得的序列采取隨機(jī)抽樣方法,并基于每個(gè)深度下抽取到的序列數(shù)及對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)繪制Specaccum物種累積曲線(圖2),結(jié)果表明,土壤樣品的Specaccum物種累積曲線在樣本數(shù)大于10時(shí)漸漸趨于平緩,說(shuō)明不同處理土壤所測(cè)的序列庫(kù)容能夠較好反映土壤細(xì)菌群落的物種數(shù)量,故測(cè)序數(shù)據(jù)基本合理。

圖2 物種累積曲線圖Fig.2 Species accumulation curve of different soil samples

表2 土壤細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)及多樣性指數(shù)分析Table 2 Sequencing data and diversity index analysis of soil bacteria

2.3 細(xì)菌OTU統(tǒng)計(jì)及多樣性分析

Venn圖能夠直觀反映不同處理間土壤細(xì)菌群落OTUs 組成的差異性及重疊關(guān)系[16]。由圖3可知,OTU水平上,TC、TF、NC和NF 4個(gè)處理中的OTU數(shù)分別為6252、5827、5867個(gè)和5936個(gè),其中共有OTU數(shù)為3166個(gè),特異性O(shè)TU數(shù)分別為802、568、573個(gè)和621個(gè),表現(xiàn)為TC>TF>NC>和TF,且共有OTU數(shù)(3166) 是4種處理中特異性細(xì)菌OTU數(shù)的4—6倍。此外,各處理特異性O(shè)TU數(shù)以TC最大,NF次之；相比NC處理,NF中的OTU數(shù)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；相比TC,TF中OTU數(shù)呈降低趨勢(shì),這說(shuō)明傳統(tǒng)耕作不覆蓋施用生物有機(jī)肥處理(TF)對(duì)土壤細(xì)菌群落OTU可能會(huì)產(chǎn)生抑制作用,而免耕覆蓋施生物有機(jī)肥處理(NF)在一定程度上則起到促進(jìn)作用。

圖3 OTUs分布的維恩圖 Fig.3 OTUs Venn distribution diagram of soil bacterial communities TF: 傳統(tǒng)耕作不覆蓋施生物有機(jī)肥Conventional tillage without mulching, and bioorganic fertilizer; TC：傳統(tǒng)耕作不覆蓋不施生物有機(jī)肥Conventional tillage without mulching, and no bioorganic fertilizer; NF: 免耕覆蓋施生物有機(jī)肥No-tillage, mulching and bioorganic fertilizer; NC: 免耕覆蓋不施生物有機(jī)肥No-tillage, mulching no bioorganic fertilizer

通過(guò)分析土壤樣品,計(jì)算得到土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)(表2)。結(jié)果顯示,不同處理下ACE指數(shù)為4092.07—4579.71,Chao1指數(shù)為3627.36—4209.83,香濃指數(shù)為10.42—10.55,辛普森指數(shù)為0.997—0.998。當(dāng)耕作覆蓋和施用生物有機(jī)肥兩因素交互作用時(shí),土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)(ACE和Chao指數(shù))表現(xiàn)為TC>NF>NC>TF；而多樣性指數(shù)(Simpson和Shannon指數(shù))卻呈相反趨勢(shì),表現(xiàn)為：NF>NC>TC>TF。與TF處理相比,NF處理中,shannon指數(shù)和Chao指數(shù)分別增加了12.5%和7.95%。而Simpson 指數(shù)降低了2.73%。整體上,傳統(tǒng)耕作在一定程度上增加了土壤細(xì)菌群落的多樣性指數(shù),降低了豐富度指數(shù)。

2.4 細(xì)菌門水平相對(duì)豐度

通過(guò)對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,從4個(gè)處理中獲得土壤細(xì)菌菌群分屬于27門、86綱、125目、213科和315屬。在門水平上,共獲得34個(gè)類群(包括未鑒定類群和其他)。將相對(duì)豐度< 1%的類群歸為其他,得到20個(gè)類群(圖4)。其中放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteri)為優(yōu)勢(shì)菌門(相對(duì)豐度≥1%),其相對(duì)豐度分別為26.90%、26.20%、15.80%和13.50%。而芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospira)、浮霉菌門(Planctomycetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等是非優(yōu)勢(shì)菌門(相對(duì)豐度≤1%)。由圖4可知,耕作和施肥兩因素均對(duì)土壤細(xì)菌門水平相對(duì)豐度產(chǎn)生了影響,其中綠彎菌門和酸桿菌門的相對(duì)豐度在不施用生物有機(jī)肥處理中均表現(xiàn)為NC>TC；而施用生物有機(jī)肥時(shí),綠彎菌門的相對(duì)豐度呈現(xiàn)NF

圖4 門水平上土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成Fig.4 The composition of soil bacterial community at phylum level

通過(guò)熱圖的顏色變化梯度和相似性能夠驗(yàn)證物種群落組成的差異性和相似性。從土壤細(xì)菌的前50個(gè)屬的熱圖分析發(fā)現(xiàn)(圖5)。4種處理中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生了顯著變化。其中TF處理中,綠彎菌門的玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)的相對(duì)豐度較高；NF處理下放線菌門中的類諾卡氏菌屬(Nocardioides)和土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)為優(yōu)勢(shì)菌屬；TC處理的變形菌門中(Proteobacteria)的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Nordella屬、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium),酸桿菌門中的芽孢桿菌屬(Blastocatella)具有較其他處理更高的豐度分布特征；NC處理中Haliangium屬和擬孢囊菌屬(Kibdelosporangium)占據(jù)較高豐度。此外,TF和NF、TC和NC聚為一類,說(shuō)明在免耕和施用生物有機(jī)肥的交互作用下,主要以是否施用生物有機(jī)肥為主導(dǎo)因素。

圖5 各處理土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在屬水平的群落熱圖分析Fig.5 Heat map analysis of the main bacteria at the genus level in each treatment soilAcidobacteria: 酸桿菌門;Actinobacteria： 放線菌門; Gemmatimonadetes: 芽單胞菌門; Chloroflexi: 綠彎菌門; Proteobacteria: 變形菌門; Nordella屬; 鞘氨醇單胞菌: Sphingomonas; 慢生根瘤菌: Bradyrhizobium; 芽孢桿菌屬: Blastocatella; 硝化螺菌屬: Nitrospira; H16; Bryobacter; Acidibacter屬; 芽單胞菌屬: Gemmatimonas; RB41; Aeromicroiumshu屬; Stenotrophobacter; Variibacter; CL500-29_marine; OM27_clade; 紅游動(dòng)菌屬: Rhodoplanes; Ilumatobacter屬; Gaiella屬; Actinophytocola屬; 未鑒定的放線菌屬: Actinobacteria_unidentified; 紅色桿菌屬: Rubrobacter; 玫瑰彎菌屬: Roseiflexus; 假節(jié)桿菌屬: Pseudarthrobacter; 土微菌屬: Pedomicrobium; Kibdelosporangium; Haliangium; 韓國(guó)生工菌屬: Kribbella; 未鑒定的酸桿菌屬: Acidobacteria_unidentified; 指孢囊菌屬: Dactylosporangium; 倫茨氏菌屬: Lentzea; 游動(dòng)放線菌屬: Actinoplanes; Virgisporangium; 壤霉菌屬: Agromyces; 芽球菌屬: Blastococcus; 地嗜皮菌屬: Geodermatophilus; Skermanella; Candidatus_Alysiosphaera屬; 假諾卡氏菌屬: Pseudonocar Haliangiumdia; 鏈霉菌屬: Streptomyces; 小單孢菌屬: Micromonospora; 分枝桿菌屬: Mycobacterium; Iamia 屬; Parviterribacter; 土壤紅桿菌屬: Solirubrobacter; 類諾卡氏菌屬: Nocardioides; Devosia; Microvirga屬; 纖維菌屬: Cellulomonas

2.4.1細(xì)菌門水平相對(duì)豐度差異性分析

不同處理中土壤細(xì)菌群落在門水平上的相對(duì)豐度差異性分析結(jié)果表明(圖6)。土壤細(xì)菌中的酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)和螺旋體菌門(Saccharibacteria)的相對(duì)豐度在TF與NC處理間有顯著差異(P=0.046、P=0.018、P=0.013和P=0.016)；放線菌門(Actinobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對(duì)豐度在NF與NC處理間也有顯著差異(P=0.042、P=0.023、P=0.032和P=0.040)。當(dāng)耕作和施用生物有機(jī)肥兩因子交互時(shí),硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對(duì)豐度在TF和NF中均達(dá)到顯著水平(P=0.0212)；而變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度在TF與TC處理間有顯著差異(P=0.026)。此外,芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)在NF與NC之間也達(dá)到極顯著水平(P=0.005)。由此說(shuō)明,施用生物有機(jī)肥會(huì)顯著影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上差異。

圖6 不同處理土壤細(xì)菌群落組成在門水平的差異分析Fig.6 The differential analysis of soil bacterial community of soil samples of the different treatments based on the phylum level

2.4.2不同處理下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

基于R軟件,采用非度量多維尺度分析(NMDS,Nonmetric multidimensional scale analysis)來(lái)反映土壤細(xì)菌群落的β多樣性(Stress=0.106)。如圖7顯示,不同處理對(duì)土壤細(xì)菌群落β多樣性產(chǎn)生了明顯影響,且形成了不同的群落空間分布結(jié)構(gòu)。在不施用生物有機(jī)肥處理時(shí),TC和NC處理的細(xì)菌群落在空間分布上相對(duì)較集中；但當(dāng)施入生物有機(jī)肥后,TC和TF、NC和NF處理卻出現(xiàn)明顯分離,差異較大。

圖7 不同處理土壤細(xì)菌非度量多維尺度分析(NMDS)分布 Fig.7 The distribution of soil bacteria in different treatments was analyzed on a nonmetric multidimensional scaleTF: 傳統(tǒng)耕作不覆蓋施生物有機(jī)肥Conventional tillage without mulching, and bioorganic fertilizer; TC：傳統(tǒng)耕作不覆蓋不施生物有機(jī)肥Conventional tillage without mulching, and no bioorganic fertilizer; NF: 免耕覆蓋施生物有機(jī)肥No-tillage, mulching and bioorganic fertilizer; NC: 免耕覆蓋不施生物有機(jī)肥No-tillage, mulching no bioorganic fertilizer

利用主成分分析發(fā)現(xiàn)(圖8a),土壤細(xì)菌的豐富度指數(shù)(ACE和Chao1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Simpson和Shannon指數(shù))與土壤pH、速效磷和C/N比成正相關(guān),與土壤全氮、堿解氮、含水量、有機(jī)碳和微生物生物量碳成負(fù)相關(guān)。對(duì)細(xì)菌群落分布的共同解釋為88.57%。其中在門水平分類學(xué)組成中,放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對(duì)豐度均與土壤含水量、堿解氮、有機(jī)碳、微生物生物量碳成正相關(guān),與土壤pH、速效鉀呈負(fù)相關(guān)(圖8b)；擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度與土壤速效鉀和全磷成正相關(guān),與微生物生物量碳、C/N比和有機(jī)碳含量均呈負(fù)相關(guān)。芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)與土壤速效鉀、C/N比呈正相關(guān)；其中非優(yōu)勢(shì)門浮霉菌門(Planctomycetes)與土壤C/N、pH和堿解氮成正相關(guān),與土壤速效鉀、含水量成負(fù)相關(guān)。主成分1和主成分2分別占85.68%和9.37%,兩個(gè)排序軸累計(jì)變量能在95.05%上解釋細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的差異性。另外,細(xì)菌門水平分類學(xué)組成與第一、二排序軸之間的相關(guān)性較高,其中pH和土壤微生物生物量碳(SMBC)分別是酸桿菌門和放線菌門的主要驅(qū)動(dòng)因子。

圖8 細(xì)菌多樣性指數(shù)及門水平類群分布與土壤理化性狀間的多元分析(PCA)Fig.8 Multivariate analysis of bacterial diversity index, the distributionof soil bacterial communities based on the phylum level between soil physical and chemical characteristicsActino: Actinobacteria 放線菌門；Proteo: Proteobacteria 變形菌門；Chloro: Chloroflexi 綠彎菌門；Acido: Acidobacteria 酸桿菌門；Gemm: Gemmatimonadetes 芽單胞菌門；Nitro: Nitrospirae 硝化螺旋菌門；Plancto: Planctomycetes 浮霉菌門；Bactero: Bacteroidetes 擬桿菌門；pH、TN、TP、AP、AN、AK和TOC、SWC、C/N ration、SMBC分別指土壤pH、全氮、全磷、速效磷、堿解氮、速效鉀和有機(jī)碳、土壤含水量、碳氮比、土壤微生物生物量碳；Chao1、ACE、Shannon、Simpson分別指Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、香濃指數(shù)和辛普森指數(shù);圖中各形狀代表不同處理;NC(1—4)表示免耕、覆蓋和不施生物有機(jī)肥的4個(gè)重復(fù); NF(1—4)表示免耕、覆蓋和施生物有機(jī)肥的4個(gè)重復(fù);TC(1—4)表示傳統(tǒng)耕作、不覆蓋和不施肥的四個(gè)重復(fù);TF(1—4)表示傳統(tǒng)耕作不覆蓋和施生物有機(jī)肥的四個(gè)重復(fù)

2.5 不同處理對(duì)冬小麥產(chǎn)量的影響

由表3可知,冬小麥的產(chǎn)量在4種處理中均有明顯差異。2016年表現(xiàn)為NF>TF>TC>NC。在傳統(tǒng)耕作不覆蓋和免耕覆蓋兩種處理中,以施用生物有機(jī)肥處理最明顯。其中NF處理冬小麥產(chǎn)量最高達(dá)到3031.25 kg/hm2。而2017和2018年,傳統(tǒng)耕作措施下,相比不施用生物有機(jī)肥處理,施用生物有機(jī)肥處理顯著增加了冬小麥產(chǎn)量(P<0.05),以2018年冬小麥產(chǎn)量增加最顯著,達(dá)到22.25%。在綜合因素影響下,尤以傳統(tǒng)耕作施用生物有機(jī)肥處理效果最佳。隨種植時(shí)間延長(zhǎng),無(wú)論是否施用生物有機(jī)肥,免耕覆蓋處理下冬小麥產(chǎn)量均呈降低趨勢(shì),而傳統(tǒng)耕作處理卻呈增加趨勢(shì)。分析認(rèn)為這可能與當(dāng)年氣候條件、耕作措施和施肥因子等綜合因素有關(guān)。

表3 不同處理對(duì)冬小麥產(chǎn)量的影響Table 3 The Effects of different treatments on yield of winter wheat

為進(jìn)一步分析冬小麥產(chǎn)量與土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群的關(guān)系,將細(xì)菌前8門優(yōu)勢(shì)菌群與冬小麥產(chǎn)量作相關(guān)分析,結(jié)果表明(表4)：冬小麥產(chǎn)量與土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度均無(wú)相關(guān)性；而土壤硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)與酸桿菌門(Acidobacteria)顯著正相關(guān)(P<0.05)；放線菌門(Actinobacteria)與土壤酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)均呈極顯著負(fù)相關(guān)；變形菌門(Proteobacteria)與綠彎菌門(Chloroflexi)也呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),說(shuō)明土壤微生物功能群落之間存在更多的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

表4 作物產(chǎn)量與土壤細(xì)菌豐度Pearson相關(guān)性Table 4 Pearson correlation between crop yield and soil bacterial abundance

3 討論

3.1 不同處理對(duì)土壤理化性質(zhì)及冬小麥產(chǎn)量的影響

有研究證實(shí),土地利用方式不同,會(huì)造成土壤理化性質(zhì)出現(xiàn)差異[17]。本研究中,持續(xù)冬小麥免耕、覆蓋和施用生物有機(jī)肥均能顯著增加土壤養(yǎng)分含量,降低土壤pH,提升土壤全氮、總碳含量,這與Duineveld等[18]研究結(jié)果一致。與TC和NC處理相比,TF和NF處理均顯著增加了土壤總碳和全氮含量,分析認(rèn)為生物有機(jī)肥是一種腐熟的肥料,施入后能為土壤微生物提供大量的碳源[19]。且在不覆蓋、不施生物有機(jī)肥處理的土壤中,作物根茬是有機(jī)質(zhì)的主要來(lái)源,同時(shí),施入生物有機(jī)肥后,因外源有機(jī)物的輸入,也會(huì)導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)積累[20]。另一方面,當(dāng)免耕、覆蓋與施用生物有機(jī)肥交互作用時(shí),不但有小麥穎殼、田間生草覆蓋分解后的有機(jī)物質(zhì),還有生物有機(jī)肥中的營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)入土壤,為作物提供養(yǎng)分需求。因此,在一定程度上,土壤微生物對(duì)根茬的降解速度發(fā)生改變,提高了作物根茬的殘留量[21],減少了土壤有機(jī)質(zhì)的氧化和礦化速度,最終提高了土壤中總碳的含量[22]。

免耕覆蓋作為保護(hù)性耕作技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)措施之一,對(duì)培肥土壤、提高土壤水分利用率,保證旱區(qū)作物高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。有學(xué)者[23]指出,免耕和秸稈還田等保護(hù)性措施在一定程度上會(huì)影響小麥、水稻幼苗生長(zhǎng),降低作物產(chǎn)量。本研究中,第一年,冬小麥經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量以NF處理最高,且隨種植年限的增加,相比傳統(tǒng)耕作,免耕處理產(chǎn)量出現(xiàn)大幅減產(chǎn)現(xiàn)象,尤其是2017年,差異最顯著。根據(jù)當(dāng)?shù)貧庀筚Y料顯示(圖9),2015年—2017年,研究區(qū)8—12月的總降雨量分別為191.6、128.7、252.5 mm,可判定作物播種后,2016年低降雨量導(dǎo)致苗期持續(xù)干旱,可能是影響2017年冬小麥產(chǎn)量降低的根本原因。另外,本研究中,相比傳統(tǒng)耕作,免耕處理土壤容重上、中、下層均增加,其中以10—15 cm耕層土壤容重增加最顯著,可能是引起土壤板結(jié),造成水肥氣熱條件不協(xié)調(diào),最終影響作物產(chǎn)量的另一因素。這與王峻等[24]的研究結(jié)果一致。此外,研究中,相比不施生物有機(jī)肥處理,兩種施肥處理(NF和TF)中,2016—2018年冬小麥的產(chǎn)量均高于不施生物有機(jī)肥處理,這說(shuō)明,施用生物有機(jī)肥,具有增產(chǎn)作用,其機(jī)制主要是生物有機(jī)肥中含有的芽孢桿菌,適于生活在各種環(huán)境中,耐受性和穩(wěn)定性極強(qiáng),能夠促進(jìn)土壤無(wú)效硅磷鉀的轉(zhuǎn)化,增加土壤硅磷鉀的供給,提高作物產(chǎn)量的能力導(dǎo)致[25],其深層原因還有待進(jìn)一步探究。

圖9 2015—2018年研究區(qū)降雨量分布情況 Fig.9 Preipitationl distribution in the study area from 2015 to 2018

3.2 不同處理對(duì)土壤細(xì)菌Alpha多樣性的影響

土壤微生物作為評(píng)價(jià)土壤的重要生物學(xué)指標(biāo),因不同的農(nóng)業(yè)管理措施,其群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,也會(huì)影響農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換[22]。如李雨澤等[26]研究發(fā)現(xiàn),地膜覆蓋土壤細(xì)菌豐富度降低,秸稈還田細(xì)菌多樣性增加,而施用生物有機(jī)肥土壤細(xì)菌的多樣性也隨之增加[27]。本研究中,4種處理方式對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)(Simpson指數(shù))和豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù))均產(chǎn)生了不同程度的影響。TF處理土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)(ACE指數(shù))提高,多樣性降低,而NF處理卻相反。分析認(rèn)為這與傳統(tǒng)耕作措施,土壤頻繁擾動(dòng)促進(jìn)土壤碳源和氮源的轉(zhuǎn)化有關(guān)[28]。

土壤微生物多樣性往往受植被類型、作物種類、土壤質(zhì)地、pH、水分和通氣等因素的影響[29]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),土壤pH和有機(jī)碳是影響不同混交林中土壤細(xì)菌多樣性的主要環(huán)境因子；全氮和含水量是影響沙地土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)和多樣性的主導(dǎo)因子[30]。大量研究指出,土壤微生物在某種程度上,對(duì)干旱的響應(yīng)較大,一定強(qiáng)度的干旱會(huì)提高土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性,適宜的土壤水分條件則能為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造良好條件,維持細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性[31-32]。這與本研究中土壤含水量與細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)成負(fù)相關(guān)性的結(jié)果相似。此外,土壤pH 的變化也是引起不同管理制度中土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的另一主要貢獻(xiàn)因子[32]。

3.3 不同處理對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響

Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為微生物的研究提供了一個(gè)強(qiáng)大高效的平臺(tái),能夠快速有效地分析土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成[33]。有學(xué)者[34]認(rèn)為,土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的整體組成在不同生境中的差異可能較大,但優(yōu)勢(shì)菌群基本相似。在本研究中,4種處理下土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門均為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門,相對(duì)豐度之和超過(guò)80%,但各處理中的相對(duì)豐度各有差異,這與以往的一些研究相似[35-36]。與傳統(tǒng)耕作處理相比,免耕覆蓋處理下,土壤酸桿菌門、放線菌門和變形菌門的相對(duì)豐度提高了30.17%—35.11%,這主要是是由于殘茬及生草覆蓋后,為微生物提生命活動(dòng)提供了有機(jī)碳源,刺激了土壤微生物的活性,加快了自身的物質(zhì)合成,使其豐度明顯增加[37]。其中,酸桿菌門在NF處理中相對(duì)豐度最高,這可能是免耕、殘茬及生草覆蓋后,植物根系分泌物導(dǎo)致土壤pH值下降[38](表1),促進(jìn)了酸桿菌門的活動(dòng)。也可能是施用的生物有機(jī)肥中含有的“巨大芽孢桿菌+膠凍樣類芽孢桿菌”,屬于芽孢桿菌屬,是一類硅酸鹽陽(yáng)性細(xì)菌,能為土壤補(bǔ)入大量的有益微生物,在作物根部形成有益菌群,抑制土壤有害及致病微生物的繁殖等,在一定程度上,可能為土壤中優(yōu)勢(shì)菌群的繁殖創(chuàng)造了有利條件[39]。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn)具有降解土壤污染物功能的芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和將土壤中的亞硝酸氧化為硝酸鹽的硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對(duì)豐度在施入生物有機(jī)肥后分別降低了5.5%—8.6%和1.1%—2.6%,說(shuō)明生物有機(jī)肥可能會(huì)抑制土壤污染物降解和氮肥力的提高[40]。另外,與其他3種處理相比,變形菌門中(Proteobacteria)能夠利用苯甲酸、水楊酸等物質(zhì)作為唯一碳源,降解土壤有毒物質(zhì),具有抵抗植物病原菌作用,適合生長(zhǎng)在高度貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的[41]鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在傳統(tǒng)耕作不施生物有機(jī)肥(TC)處理中相對(duì)豐度最高。

有學(xué)者研究證實(shí),驅(qū)動(dòng)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生改變的主要因子是土壤全氮含量[42]。如酸桿菌門能夠降解植物殘?bào)w、參與單碳因子代謝；放線菌門參與土壤碳氮循環(huán)。而在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)土壤放線菌門與土壤堿解氮、全氮及土壤含水量呈正相關(guān),且土壤含水量是影響放線菌門的主導(dǎo)因子。這可能與土壤細(xì)菌自身屬性相關(guān)。普遍認(rèn)為,變形菌門喜養(yǎng)分含量高的土壤；酸桿菌門喜貧瘠的土壤；而放線菌門主要存在于極度干旱的環(huán)境中[43]。綜上所述,不同環(huán)境因素對(duì)微生物類群的影響不同。因此,關(guān)于免耕覆蓋、施用生物有機(jī)肥等交互效應(yīng)改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

免耕覆蓋、生物有機(jī)肥施用對(duì)土壤理化性質(zhì)均產(chǎn)生了一定影響,顯著增加了土壤總有機(jī)碳、總氮的含量，降低了土壤pH、C/N比和冬小麥的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。與傳統(tǒng)耕作相比,免耕覆蓋施用生物有機(jī)肥提高了土壤細(xì)菌Simpson多樣性指數(shù),降低了Chao1豐富度指數(shù),且耕作和施用生物有機(jī)肥兩種因素均對(duì)土壤細(xì)菌群落分布產(chǎn)生了影響,其中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌群。速效鉀和C/N比則是影響細(xì)菌群落組成中變形菌門和酸桿菌門相對(duì)豐度的主要驅(qū)動(dòng)因子。