相會明，李先偉，馬瑞燕

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷030801）

梨小食心蟲，簡稱“梨小”，屬鱗翅目（Lepidoptera）、卷蛾科（Tortricidae），是一種重要的蛀果性害蟲，廣泛分布于我國主要桃梨產(chǎn)區(qū)［1］。梨小寄主范圍集中在薔薇科的核果類和仁果類果樹，其中桃被認(rèn)為是第一寄主，梨為第二寄主。梨小具有寄主轉(zhuǎn)移的為害特性，幼蟲在春季蛀食桃樹嫩梢，而在秋季為害桃、梨和蘋果等的果實(shí)［2］。多年來梨小的生物防治研究主要在以性信息素為基礎(chǔ)的大量誘捕和迷向防治領(lǐng)域，由于梨小具有鉆蛀性強(qiáng)、寄主轉(zhuǎn)移和雌蛾飛行能力強(qiáng)等特點(diǎn)，導(dǎo)致這種防治手段存在多種弊端［3］。鑒于此，在梨小治理過程中，針對雌蛾的防治比雄蛾防治更加有效。

植物的次生物質(zhì)在昆蟲和植物的協(xié)同進(jìn)化過程中發(fā)揮重要作用［4］，如植食性昆蟲主要依賴寄主揮發(fā)物質(zhì)進(jìn)行寄主定向和產(chǎn)卵選擇，因此可以利用寄主植物的揮發(fā)物進(jìn)行害蟲監(jiān)測與治理［5］。梨小寄主定位與揮發(fā)物之間的關(guān)系近年來受到國內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注。Natele［6］等通過室內(nèi)嗅覺雙選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苯甲醛、Z-3-己烯醇和Z-3-己烯乙酸酯按照4∶1∶1體積比組成的混合物對梨小雌蛾有較強(qiáng)的引誘作用。國內(nèi)學(xué)者通過田間試驗(yàn)驗(yàn)證，梨果中的揮發(fā)物對梨小雌雄蛾均具有引誘活性，但在田間的誘蛾量偏少［7］。目前國內(nèi)外關(guān)于梨小雌蛾引誘活性物質(zhì)的研究多集中于寄主揮發(fā)物中的天然混合物，且田間誘蛾效果較差。針對寄主揮發(fā)物中的單一揮發(fā)性萜類在梨小寄主定位中的作用及機(jī)制并未開展研究。大量研究指出，短鏈萜類（C5-C20）化合物是植食性昆蟲遠(yuǎn)距離通訊的重要化學(xué)物質(zhì)［8］。因此，探索寄主揮發(fā)物中的萜類化合物在梨小雌蛾寄主定位中的作用，并開發(fā)梨小雌蛾的植物引誘劑勢在必行。

本研究采用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）對桃梢揮發(fā)物中的萜類物質(zhì)進(jìn)行分析，通過田間試驗(yàn)研究桃梢揮發(fā)物中萜類物質(zhì)對于梨小的引誘作用，并進(jìn)一步探究萜類物質(zhì)對梨小性信息素是否具增效作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物

供試植物為桃樹新梢，桃樹品種為“大久?！保N植于山西省農(nóng)科院果樹所桃資源圃，樹齡10年。

1.1.2 儀器和試劑

試劑：Z-β-羅勒烯（異構(gòu)體混合物，含量≥90%，Sigma-Aldrich有限公司），α-法呢烯（異構(gòu)體混合物，含量≥90%，Sigma-Aldrich有限公司），α-蒎烯（98%，阿拉丁試劑有限公司），正己烷（色譜級，阿拉丁試劑有限公司），吸附劑ProPak Q（80目，色譜科），梨小性誘芯包含200μg梨小性信息素（北京格瑞碧源公司提供）。

儀器：QC-1S型大氣采樣儀（北京勞動(dòng)保護(hù)研究所），移液槍（艾本德有限公司）7890A-5975C型氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司），三角型誘捕器（北京格瑞碧源公司）。

揮發(fā)物頂空吸附裝置：用聚四氟乙烯管將QC-1S型大氣采樣儀、裝有活性炭和分子篩的過濾瓶、10 L玻璃采樣罐（直徑20 cm，上部有進(jìn)氣孔和出氣孔）及吸附管（100 mg吸附劑）按順序連接而成。

1.2 方法

1.2.1 桃梢揮發(fā)物的提取

將3枝桃梢置于采樣罐內(nèi)，連接裝置，大氣采樣儀流量設(shè)置為200 mL·min-1，室溫下抽提4 h。抽提結(jié)束后，立即采用2 mL正己烷對吸附管進(jìn)行洗脫，洗脫液于樣品瓶中?18℃保存。進(jìn)樣前，用氮?dú)鈱⑾疵撘簼饪s至每樣品瓶100μL。本試驗(yàn)共重復(fù)6次。

1.2.2 桃梢揮發(fā)物的分析

將濃縮后的洗脫液于GC-MS中進(jìn)行分析。進(jìn)樣量為1μL。GC-MS分析條件如下：

（1）氣相色譜條件：

色 譜 柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；氦氣做載氣，流量為3 mL·min-1；采用不分流模式進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度：230℃；柱箱起始溫度50℃，保持3 min，以3℃·min-1程序升溫至120℃，再以8℃·min-1升溫至240℃，保持5 min。

（2）質(zhì)譜條件為：

離子源：EI源，電子能量70 eV；離子源溫度：230℃；單重四極桿溫度：150℃；全掃描，溶劑延時(shí)3 min；物質(zhì)定性采用nist08標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)庫比對，相似度高于85%。

1.2.3 萜類物質(zhì)誘蛾活性的測定

本 試 驗(yàn) 于2016年5月30日-2016年6月15日在山西省太谷縣井神村桃園進(jìn)行。每個(gè)空白誘芯中添加一定劑量的單一萜類化合物，化合物劑量梯度為：0.1、1、10、100 mg。將誘芯置于三角型誘捕器內(nèi)部，距離粘蟲板上方2 cm。隨后將誘捕器懸掛于桃樹陰涼處，距離地面1.5 m左右，每2個(gè)誘捕器間距為25 m。每一劑量處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含6個(gè)誘捕器，所有誘捕器隨機(jī)懸掛。分別以不添加任何化合物的空白誘芯（CK）作為對照。每3天收集一次粘蟲板，帶回實(shí)驗(yàn)室鑒定所誘梨小性別并統(tǒng)計(jì)誘蛾量。

1.2.4 萜類物質(zhì)對梨小性信息素增效作用測定

在梨小性誘芯中添加不同劑量的萜類化合物測試寄主揮發(fā)物中的萜類物質(zhì)對梨小性信息素增效作用。同時(shí)使用梨小性誘芯為對照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)置6個(gè)誘捕器，誘捕器及誘芯田間設(shè)置與1.2.3中田間設(shè)置相同。試驗(yàn)時(shí)間為：2016年8月6日-2016年8月24日，試 驗(yàn) 地 點(diǎn) 為 山西省太谷縣西山底村桃園。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

桃梢揮發(fā)物相對含量分析采用面積歸一化法。每天田間平均誘蛾量經(jīng)余弦轉(zhuǎn)換后，采用單因素方差分析，并使用Tukey’s HSD進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃梢揮發(fā)物鑒定

采用動(dòng)態(tài)頂空吸附結(jié)合GC-MS對桃梢揮發(fā)物進(jìn)行分析（圖1），結(jié)果表明（表1）桃梢中共檢測到13種揮發(fā)性化合物，其中包括萜烯類、醇類、醛類和酯類四大類。在4類物質(zhì)中，萜烯類物質(zhì)含量最高，占總揮發(fā)物含量80%以上，其中5種主要萜烯的含量順序?yàn)閆-β-羅勒烯（73.47%）、α-法呢烯（8.07%）、β-法 呢 烯（0.81%）、E-β-羅 勒 烯（0.65%）和α-蒎烯（0.36%）。醇類化合物中，芳樟醇（2.7%）的含量高于Z-3-己烯醇（0.21%）。此外，檢測到3種醛類物質(zhì)，含量順序由高到低依次為：苯甲醛（3.41%）、癸醛（0.93%）和壬醛（0.61%）。在檢測到的3種酯類化合物中，水楊酸甲酯的含量最高。

圖1 桃梢揮發(fā)物氣相色譜圖Fig1 Gas chromatogram of volatiles in peach shoots

2.2 萜類物質(zhì)誘蛾活性測定結(jié)果

田間試驗(yàn)測定了Z-β-羅勒烯、α-法呢烯和α-蒎烯在4個(gè)劑量下對梨小的引誘作用，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，1 mg劑量的Z-β-羅勒烯對梨小的引誘作用（65.86±23.12頭）顯著高于其他3種劑量處理，其誘蛾效果為梨小性信息素的75.2%。4種劑量Z-β-羅勒烯的誘蛾量均顯著低于梨小性信息素的誘蛾量（87.58±24.46頭）（F5，107=3.38，P=0.026）。4種劑量α-法呢烯的誘蛾量均顯著低于梨小性信息素誘蛾量（F5，107=10.473，P=0.038），且4種劑量的誘蛾量差異不顯著。100 mgα-蒎烯的誘蛾量（5.61±3.24頭）顯著低于其他3種劑量的α-蒎烯的誘蛾量（F5，107=11.54，P=0.016），且其他3種劑量α-蒎烯對梨小的引誘量差異不顯著。所有處理的誘蛾量均顯著高于空白對照，且所有誘捕器中所誘梨小均為雄蛾（圖2）。

2.3 萜類物質(zhì)對梨小性信息素增效作用

萜類物質(zhì)對梨小性信息素的增效作用田間試驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，與單獨(dú)使用梨小性誘劑相比，1 mg Z-β-羅勒烯對梨小性誘芯具有顯著的增效作用（F4，89=10.86，P＜0.05），可提高誘捕數(shù)量的1.5倍，但其他劑量Z-β-羅勒烯對梨小性誘劑增效作用不顯著。梨小性誘芯中添加1 mgα-法呢烯可以顯著提高梨小性誘芯的誘蛾量（F4，89=16.35，P＜0.05），其他劑量法呢烯的增效不顯著。4種劑量的α-蒎烯對梨小性誘劑的增效作用均不顯著（F4，89=33.69，P=0.58）。

圖2 萜類物質(zhì)劑量對梨小雄蛾誘蛾量影響Fig 2 Effects of terpenoids at different doses on the mean catching number of male OFM

表1 桃梢主要揮發(fā)物成分Table1 Main volatile components in peach shoots

3 討論

萜烯類物質(zhì)在卷葉蛾科果樹害蟲的寄主轉(zhuǎn)移與產(chǎn)卵選擇過程中起關(guān)鍵作用。在蘋果蠹蛾從蘋果樹嫩梢向成熟蘋果轉(zhuǎn)移過程中，α-法呢烯是引起寄主轉(zhuǎn)移機(jī)制的主要嗅覺因素［9］。經(jīng)行為學(xué)驗(yàn)證，α-法尼烯和E-β-石竹烯對葡萄花翅小卷蛾產(chǎn)卵場所選擇行為有重要影響［10］。而根據(jù)我們的萜類物質(zhì)田間誘蛾試驗(yàn)結(jié)果，所有處理只引誘到梨小雄蛾，未引誘到梨小雌蛾。Il’ichev等［11］將Z-3-己烯乙酸酯、E-β-羅勒烯和E-β-法尼烯按照比例1∶2∶2組成的混合誘芯進(jìn)行田間試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合誘芯僅對梨小雄蛾有引誘作用。田間試驗(yàn)中，萜類物質(zhì)未誘到梨小雌蛾的原因可能與梨小食心蟲寄主識別過程中其他因素有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，梨小雌蛾偏好在黃色和綠色基質(zhì)上產(chǎn)卵［12］。此外，宮慶濤等［13］通過研究梨小食心蟲產(chǎn)卵與桃果品種關(guān)系，指出寄主表面絨毛的疏密程度是影響梨小食心蟲產(chǎn)卵選擇的首要物理因素，且油桃上梨小產(chǎn)卵量為毛桃40倍。寄主植物的物理特征也是植食性昆蟲寄主識別的重要線索［14］。因此，在開發(fā)梨小食心蟲雌蛾引誘劑設(shè)計(jì)過程中，不僅關(guān)注梨小寄主揮發(fā)物，而且需要考慮寄主的形態(tài)、顏色和表面結(jié)構(gòu)對梨小食心蟲寄主定位行為的影響。

目前針對植食性昆蟲性信息素增效作用的研究，多以綠葉類揮發(fā)物質(zhì)為主，而萜類物質(zhì)較少［15］。本文首次揭示了寄主植物中的萜類物質(zhì)對梨小食心蟲性信息素具有增效作用。寄主植物中的揮發(fā)性萜類物質(zhì)，對其它鱗翅目害蟲亦具有增效作用。比如，在美國白蛾（Hyphantria Cunea）性誘芯中添加少量β-羅勒烯，顯著提升誘芯的誘捕量［16］。蘋果蠹蛾雄蟲在法呢烯存在條件下，對其性信息素反應(yīng)強(qiáng)度顯著提高［17］。因此在鱗翅目害蟲性信息素增效劑的研究工作中，寄主中的揮發(fā)性萜類物質(zhì)應(yīng)作為重點(diǎn)對象。

植物揮發(fā)物對昆蟲性信息素的增效作用取決于化合物的種類和劑量。本研究結(jié)果表明，1 mg的Z-β-羅勒烯和α-法呢烯對梨小食心蟲性信息素增效作用顯著。當(dāng)Z-β-羅勒烯劑量大于1 mg后，增效作用隨劑量呈負(fù)相關(guān)。在綠葉揮發(fā)物對梨小食心蟲性信息素有增效作用研究中指出，50μg的Z-3-己烯乙酸酯增加梨小性誘劑的誘捕量，200μg的Z-3-己烯乙酸酯降低梨小性信息素的誘捕能力［18］。沈幼蓮等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，0.4 mg的苯乙醛可以顯著提高斜紋夜蛾Spodoptera litura的性誘劑引誘效果，高劑量的苯乙醛有抑制作用。在開發(fā)昆蟲性信息素增效劑過程中，需關(guān)注增效劑的種類與劑量。

4 結(jié)論

圖3 萜類物質(zhì)劑量對梨小性信息素增效作用影響Fig.3 Effects of the mixtures of terpenoids at different doses and sex lure on mean catches of male OFM

本研究通過GC-MS對桃梢揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，Z-β-羅勒烯、E-β-羅勒烯、α-法呢烯、β-法呢烯、和α-蒎烯等5種萜類化合物被檢出。在桃梢揮發(fā)物中，Z-β-羅勒烯占總揮發(fā)物的73.47%。田間誘蛾試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1 mg劑量的β-羅勒烯對梨小雄蛾的誘蛾活性顯著高于其他處理。田間增效試驗(yàn)結(jié)果表明，1 mgβ-羅勒烯或法呢烯對梨小性信息素增效作用最強(qiáng)。兩種萜類化合物與梨小性信息素的協(xié)同增效作用，為開發(fā)梨小新型引誘劑及梨小食心蟲的綜合治理提新的依據(jù)和思路。