衛(wèi)銀，侯笑笑，杜笑，常明昌，2，孟俊龍，2，劉靖宇，2*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷030801；2.黃土高原食用菌提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 太谷030801）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北冬蟲夏草，隸屬于子囊菌亞門、核菌綱、球殼目、麥角菌科，蟲草屬，是一種寄生在鱗翅目昆蟲體內(nèi)的真菌［1］。目前，我國蛹蟲草已實現(xiàn)較大規(guī)模的生產(chǎn)，并在2009年被我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品［2］。蛹蟲草中含有多糖、蟲草素、核苷、甾醇和色素等多種活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、改善慢性腎病和降血糖等藥理活性［3～6］。其中多糖作為其最主要的生物活性物質(zhì)之一，現(xiàn)已成為功能食品研究領(lǐng)域的熱點［7，8］。

胞外多糖是一種可通過液體發(fā)酵技術(shù)，快速實現(xiàn)大量制備的菌株胞外活性代謝產(chǎn)物。目前，食用菌已成為制備功能性胞外多糖的重要真菌資源，其胞外多糖可作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和非特異性免疫刺激劑用于相關(guān)疾病的治療［9～11］?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明：不同提取條件對后續(xù)進(jìn)行多糖提取效率、組分分離純化，以及組分活性篩選的研究均會產(chǎn)生重要影響［12～14］。然而，現(xiàn)有蛹蟲草胞外多糖的研究主要集中于對其液體發(fā)酵的最適培養(yǎng)基組分、液體發(fā)酵條件、生物學(xué)活性等方面［15～18］，關(guān)于其胞外多糖具體提取工藝優(yōu)化的研究少有報道。為此，本研究以蛹蟲草液體發(fā)酵液為供試材料，通過Box-Behnken實驗設(shè)計對蛹蟲草胞外多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用MTT法檢測其對結(jié)腸癌的抑制作用，以期為后續(xù)的結(jié)構(gòu)鑒定和抗結(jié)腸癌活性等的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

蛹蟲草菌株CM-1由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供。人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-116購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢）。

1.1.2供試培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1、葡萄 糖15 g·L-1、瓊 脂20 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1；

平 板培養(yǎng) 基：馬鈴 薯100 g·L-1、葡萄 糖15 g·L-1、瓊脂20 g·L-1、酵母膏5 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1；

發(fā)酵用液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、酵母膏5 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、MgSO40.6 g·L-1；

F12細(xì)胞培養(yǎng)基：F12復(fù)合培養(yǎng)基粉末、NaHCO32.438 g·L-1、胎牛血清10%、青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液1%、雙蒸水配置。

1.1.3 主要試劑與儀器

3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購自igma-Aldrich；胰蛋白酶購自山西百奧生物技術(shù)有限公司；瓊脂、酵母膏和青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液購自Solarbio公司；胎牛血清（FBS）購自Biological Industries；濃硫酸（優(yōu)級純）成都市科龍化工試劑廠；基本化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

LS-75HD型立式壓力蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；RGX型恒溫?fù)u床和DF-1001S型磁力攪拌器（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；MultifugeX1R型高速冷凍離心機(jī)和Orion StarA型pH計（賽默飛世爾科技有限公司）；CHB-202型恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆籆ary60型紫外可見光分光光度計（安捷倫科技有限公司）；HF240型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；TS100型倒置顯微鏡（尼康）；Infinite F50酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蛹蟲草發(fā)酵液的制備

在長勢良好的PDA平板培養(yǎng)基上打孔（直徑10 mm的圓形菌種塊）若干，取3～5個菌塊接種到每個裝有150 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在25℃的恒溫?fù)u床中靜置培養(yǎng)20 h后，以150 r·min-1的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)144 h。將發(fā)酵培養(yǎng)完全的蛹蟲草發(fā)酵液減壓過濾，分離菌絲體與深層發(fā)酵培養(yǎng)液，將發(fā)酵液置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛹蟲草胞外多糖的提取

將制備好的發(fā)酵液在4 000×g下離心10 min，收集上清液，旋蒸濃縮。利用Sevage法除蛋白［12］：加入1/3體積的sevage試劑（氯仿∶正丁醇=3∶1），磁力 攪 拌器攪拌30 min，4 000×g離心15 min，收集上清液，重復(fù)操作至中間層無變性蛋白。調(diào)節(jié)所得上清液的pH，4 000×g離心15 min，收集上清液。加入無水乙醇使其終濃度達(dá)到70%，4℃下靜置24 h。醇沉后的溶液7 000×g離心15 min，收集沉淀并加入少量蒸餾水溶解，凍干即可得到蛹蟲草胞外多糖。

1.2.3 蛹蟲草胞外多糖含量的測定

參照參考文獻(xiàn)［12］制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚-硫酸法測多糖含量。配制濃度為0.1 g·L-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL于試管內(nèi)，用蒸餾水補(bǔ)至1 mL。加入5%苯酚1 mL和濃硫酸5 mL，渦旋振蕩，置于30℃金屬浴中反應(yīng)30 min，冷卻到室溫，在490 nm處檢測吸光值。

以葡萄糖溶液的濃度為X軸，吸光值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：

y=0.008 6x+0.012 1，R2=0.998 5。

準(zhǔn)確配制蛹蟲草胞外多糖溶液0.1 g·L-1，用苯酚-硫酸法測量其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品的多糖含量。

1.3 單因素試驗

發(fā)酵液濃縮比例：在1.2.2蛹蟲草胞外多糖提取方法的基礎(chǔ)上，分別以1/2、1/3、1/4、1/5、1/6為濃縮比例，考察發(fā)酵液不同濃縮比例對胞外多糖提取量的影響。

乙醇濃度：在上述試驗優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別以50%、60%、70%、80%、90%為醇沉濃度，考察不同乙醇濃度對胞外多糖提取量的影響。

醇沉?xí)r間：在上述試驗優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別以6、12、18、24、30 h為醇沉?xí)r間，考察不同醇沉?xí)r間對胞外多糖提取量的影響。

發(fā)酵液pH：在上述試驗優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別調(diào)節(jié)每組的pH為5、6、7、8、9，考察不同發(fā)酵液pH對胞外多糖提取量的影響。

以上單因素實驗的每個處理均設(shè)置3個重復(fù)。

1.4 Box?Benhnken的試驗設(shè)計

本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，觀察到醇沉?xí)r間因素所得胞外多糖產(chǎn)量變化幅度不明顯，因此只選擇濃縮比例（A）、乙醇濃度（B）、pH（C）為響應(yīng)因素，以多糖提取量為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析組合試驗（表1），以確定蛹蟲草胞外多糖的最佳提取工藝。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface

1.5 體外細(xì)胞試驗

將制備好的蛹蟲草胞外多糖溶于超純水中，用0.22μm的濾膜過濾后調(diào)至不同濃度備用。HCT-116細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%（v·v-1）胎牛血清的F12培養(yǎng)基中，在37℃，5% CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

用MTT法［5］研 究 蛹 蟲 草 胞 外 多 糖 對HCT-116細(xì)胞增殖的抑制作用。選取處于對數(shù)生長期的HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后用F12培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至每孔6.0×103細(xì)胞，在96孔板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況后，加入100μL含有不同濃度（0、0.6、1.0、1.6、2.0和2.8 g·L-1）胞外多糖的F12培養(yǎng)基，每個梯度設(shè)置五個復(fù)孔。37℃，5% CO2孵育48 h后，每孔加15μL的MTT試劑（5 g·L-1），繼續(xù)孵育4 h。然后，吸除孔中混合液，每孔加150μL DMSO溶液以溶解細(xì)胞中的甲瓚，搖床上低速振蕩10 min，在570 nm處用酶標(biāo)儀測每孔的吸光值。胞外多糖對HCT-116細(xì)胞的存活率計算公式為：

存活率/%=［A1/A0］×100%

式中：A0為空白對照組在570 nm處的吸光值；A1為實驗組在570 nm處的吸光值。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用OriginPro 8.6對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析；采用Design-Expert 7.0軟件對Box-Benhnken的結(jié)果進(jìn)行分析。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對IC50值進(jìn)行回歸分析和顯著性分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵液濃縮比例對多糖提取量的影響

隨著發(fā)酵液濃縮比例的增加，胞外多糖的提取量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢（圖1）。當(dāng)發(fā)酵液濃縮比例為1/5時，蛹蟲草胞外多糖的提取量達(dá)到最大，最大提取量為0.86 g·L-1。

圖1 濃縮比例對胞外多糖提取量的影響Fig.1 Effect of concentration ratio on the extraction rate of extracellular polysaccharide

2.1.2 乙醇濃度對多糖提取量的影響

如圖2所示，蛹蟲草胞外多糖的提取量隨著乙醇濃度的增加而升高，但當(dāng)乙醇濃度大于80%之后，提取量升高速度減緩。考慮到經(jīng)濟(jì)因素，因此選擇80%為最佳乙醇濃度。

2.1.3 醇沉?xí)r間對多糖提取量的影響

圖2 乙醇濃度對胞外多糖提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of extracellular polysaccharides

在醇沉?xí)r間梯度增加的條件下，蛹蟲草胞外多糖的提取量先逐漸增長后緩慢下降（圖3）。當(dāng)醇沉?xí)r間為24 h時，多糖達(dá)到最大提取量，最大值為0.98 g·L-1。因此選擇24 h為最佳醇沉?xí)r間。

圖3 醇沉?xí)r間對胞外多糖提取量的影響Fig.3 Effect of alcohol precipitation time on the extraction rate of extracellular polysaccharides

2.1.4 發(fā)酵液pH對多糖提取量的影響

如圖4所示，當(dāng)pH為5～8時，pH值與蛹蟲草胞外多糖的提取量成正比，pH大于8時，其對多糖提取量有抑制作用。在pH為8時，蛹蟲草胞外多糖的提取量達(dá)到最大，為1.584 g·L-1。

圖4 pH對多糖提取量的影響Fig.4 Effect of pH on the extraction rate of polysaccharide

2.2 Box?Benhnken試驗結(jié)果

綜合考慮各單因素時選擇醇沉?xí)r間為24 h，以濃縮比例（A）、乙醇濃度（B）、pH（C）為響應(yīng)因素，多糖提取量為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗。綜合考慮了3個因素彼此之間的交互作用，設(shè)計表及結(jié)果見表2?；貧w擬合分析得到二元回歸方程：

根據(jù)表3的響應(yīng)面方差分析可得，B和C2對試驗結(jié)果影響極顯著，AB、A2及B2影響顯著。試驗的P值低于0.01，說明該試驗的可信度在0.99以上。根據(jù)F值結(jié)果的分析，試驗因素的影響順序為乙醇濃度（B）＞濃縮比例（A）＞pH值（C）。

表2 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果Table 2 Program and experimental results of response surface

通過二維等高線圖和三維響應(yīng)面圖分析顯示（圖5），隨著A（濃縮比例）和C（pH）的增大，蛹蟲草胞外多糖的提取量也隨之增長，但A和C增大到一定程度后，胞外多糖的提取量有下降的趨勢，且AC交互作用響應(yīng)面圖坡度較陡且二維等高線圖呈橢圓形，說明對胞外多糖提取量的影響顯著，與方差分析的結(jié)果一致。濃縮比例和乙醇濃度交互作用響應(yīng)曲面圖坡度較平緩，表明其對胞外多糖提取量的影響不顯著；同時pH和乙醇濃度2個因素之間的交互作用也不明顯。

表3 響應(yīng)面模型的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic model

通過Design-Expert 7.0統(tǒng)計軟件，并結(jié)合響應(yīng)曲面圖和等高線圖的結(jié)果綜合分析，預(yù)測出蛹蟲草胞外多糖最佳提取工藝為：濃縮比例0.191、醇沉?xí)r間24 h、乙醇濃度88.36%、發(fā)酵液pH7.44，在該情況下蛹蟲草胞外多糖的最大提取量是1.781 g·L-1。

2.3 驗證試驗

采用上述最佳方案做驗證試驗，考慮到現(xiàn)實因素，將蛹蟲草胞外多糖最佳提取工藝改為：濃縮比例1/5、醇沉?xí)r間24 h、乙醇濃度85%、發(fā)酵液pH 7.5。在此條件下進(jìn)行驗證實驗，試驗設(shè)置3重復(fù)，最終蛹蟲草胞外多糖提取量的實驗值是1.712 g·L-1，誤差為3.87%，證明所建模型可靠。

2.4 體外細(xì)胞試驗結(jié)果

通過體外細(xì)胞試驗，考察不同給藥濃度在48 h對人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-116增殖的抑制效果。結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，蛹蟲草胞外多糖對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116顯示較好的抑制效果，同時在 濃 度0～2.8 mg·mL-1范 圍 內(nèi)，胞 外 多 糖 對HCT-116細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。當(dāng)濃度達(dá)到2 g·L-1時，抑制率達(dá)到58.10%。蛹蟲草胞 外 多 糖 對HCT-116的IC50為1.483 g·L-1。這一結(jié)果表明：蛹蟲草胞外多糖在相對較高的濃度下具有良好的抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的活性，可作為輔助性抗結(jié)腸癌藥物［17］。

圖6 不同蛹蟲草胞外多糖濃度下HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞的存活率Fig.6 Cell viability（HCT-116）of Cordyceps militaris extracellular polysaccharides at different concentrations

3 討論與結(jié)論

圖5 兩兩因素交互作用對胞外多糖提取量影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction of two or two factors on the extraction of extracellular polysaccharides

本試驗以蛹蟲草菌株為供試材料，研究了不同提取條件下，蛹蟲草液體發(fā)酵過程中胞外多糖的動態(tài)變化。且此次采用醇沉法和Sevage法提取蛹蟲草胞外多糖，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計試驗，得到蛹蟲草胞外多糖的最佳提取工藝：發(fā)酵液濃縮比例1/5、發(fā)酵液pH 7.5、乙醇濃度85%、醇沉?xí)r間24 h，采用此工藝制備的胞外多糖提取量為1.712 g·L-1，純度為56.39%。實驗結(jié)果與侯宏波［19］運用納膜濃縮，乙醇沉淀法制備發(fā)酵冬蟲夏草胞外多糖的得率1.5 g·L-1，純度50%相比，提取工藝更為穩(wěn)定、可控、簡單和高效，且胞外多糖提取量和純度都有所提升。同時，實驗結(jié)果顯示：在24 h以內(nèi)，蛹蟲草胞外多糖的提取量隨著醇沉?xí)r間的增加而增加，但當(dāng)時間超過24 h，提取量呈下降趨勢，這與MaXK等［20］關(guān)于煙曲霉胞外多糖產(chǎn)量隨著沉淀時間的增加而增加的實驗結(jié)果不一致。究其原因，可能是由于隨著醇沉?xí)r間增加，導(dǎo)致部分胞外多糖溶于無水乙醇，進(jìn)而使得提取量降低。發(fā)酵液pH在5～8的范圍內(nèi)，蛹蟲草胞外多糖的提取量與pH值呈正相關(guān)。當(dāng)發(fā)酵液pH為8時，胞外多糖的提取量達(dá)到最大值。而當(dāng)發(fā)酵液pH為9，醇沉?xí)r錐形瓶底部會出現(xiàn)一層黑色粘性物質(zhì)，多糖提取量明顯降低，這種差異的出現(xiàn)可能與胞外多糖的單糖組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)［8，21］。

體外抗結(jié)腸癌活性分析實驗的結(jié)果顯示，添加蛹蟲草胞外多糖48 h后，在體外可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的活性，其IC50為1.483 g·L-1，且在一定濃度范圍內(nèi)存在劑量依賴性。本研究成果將為蛹蟲草胞外多糖結(jié)構(gòu)與生理活性的深入研究，以及作為輔助性功能食品的開發(fā)提供重要的參考依據(jù)。