吉小鳳，呂文濤，汪建妹，廖琳慧，徐 杰，錢(qián)鳴蓉，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州310021; 2.麗水市蓮都區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心， 浙江 蓮都 323000)

民以食為天，食以安為先。食品是人類(lèi)賴(lài)以生存和發(fā)展的基本物質(zhì)，也是人們生活中最基本的必需品。近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注殺蟲(chóng)劑和其他化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)改變?nèi)祟?lèi)和野生動(dòng)物正常的內(nèi)分泌功能。內(nèi)分泌干擾物可引起多種不良反應(yīng)包括發(fā)育、生殖和行為危害等[1]。眾所周知，殺蟲(chóng)劑對(duì)嚙齒動(dòng)物和哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)具有神經(jīng)毒性[2]。

氟蟲(chóng)腈屬于苯基吡唑類(lèi)殺蟲(chóng)劑，主要作用是通過(guò)與α-氨基丁酸受體結(jié)合，抑制氯離子通道，破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而殺滅昆蟲(chóng)[3-5]。氟蟲(chóng)腈殺蟲(chóng)譜廣，可適用于水稻、玉米、棉花及其他廣泛經(jīng)濟(jì)作物的蟲(chóng)害防治中，同時(shí)還適用于非農(nóng)業(yè)領(lǐng)域殺蟲(chóng)，如可殺滅跳蚤、螨和虱[6-9]。氟蟲(chóng)腈是一種化學(xué)性質(zhì)活潑的化合物，在施用后，經(jīng)過(guò)水解、光解等作用，會(huì)生成3種代謝產(chǎn)物氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈硫醚和氟甲腈[6]。而經(jīng)過(guò)對(duì)代謝物毒性的研究，這三者的毒性要高于氟蟲(chóng)腈原藥[7]。

世界各國(guó)已對(duì)雞蛋中氟蟲(chóng)腈的殘留量制定了最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(MRL)，其中，國(guó)際食品法典(CAC)和日本食品安全標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，氟蟲(chóng)腈在蛋中的最大殘留限量為20 μg·kg-1[8]。美國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，氟蟲(chóng)腈在蛋中的最大殘留限量為30 μg·kg-1[8]。歐盟相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，氟蟲(chóng)腈在蛋中的最大殘留限量為5 μg·kg-1[8]。在保護(hù)環(huán)境和食品安全的大背景下，我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2009年發(fā)布公告停止生產(chǎn)銷(xiāo)售氟蟲(chóng)腈農(nóng)藥[9]，我國(guó)GB 2763—2019規(guī)定雞蛋中其最大殘留限量為20 μg·kg-1。

我國(guó)是雞蛋生產(chǎn)大國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年我國(guó)禽蛋生產(chǎn)量達(dá)到2 876萬(wàn)t，人均占有量約為21 kg[10]。鮮雞蛋已漸漸成為人們每日餐桌上不可或缺的食材。歐洲“毒雞蛋”事件使得鮮雞蛋的食品安全引發(fā)消費(fèi)者的關(guān)注。為了更好地了解市場(chǎng)上鮮雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留狀況，本文通過(guò)建立優(yōu)化的QuEChERS前處理方法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法開(kāi)展鮮雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留狀況分析，為鮮雞蛋質(zhì)量安全科學(xué)監(jiān)管提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)腈砜、 氟蟲(chóng)腈硫醚標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于98%，Dr.Ehrenstorfer， GmbH)；氟甲腈 (100 mg·L-1，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境科研監(jiān)測(cè)所)；乙腈(HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司)；甲醇(HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司)；甲酸(HPLC級(jí)，美國(guó)ANAQUA公司)；甲酸銨(HPLC級(jí)，北京飛美斯分析科技有限公司)；無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉(分析級(jí)，中國(guó)凌峰化工試劑有限公司)；QuEChERS分散試劑盒含50 mg PSA，50 mg C18，150 mg無(wú)水硫酸鎂(美國(guó)Agilent公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水儀制備的超純水(≥18 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(UPLC，日本島津公司)；QTRAP?6500三重四級(jí)桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)；BS2202S電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；SORVALL? Heraeus Biofuge冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Talboys數(shù)顯渦旋混合儀(美國(guó)Troemner公司)；超純水儀(美國(guó)Milli-Q公司)；KQ-100超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 儀器測(cè)定條件

ACQUITY UPLC C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為含0.1% 甲酸和2 mmol·L-1甲酸銨的水溶液；流速為0.20 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～1 min，90%～10% B；1～4 min，10% B；4～4.1 min，10%～90% B；4.1～7 min，90% B。

離子源為電噴霧離子源(ESI)；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；掃描方式為負(fù)離子掃描；噴霧電壓(IS)：-4 500 V；離子源溫度(TEM)500 ℃；氣簾氣(CUR)壓力275.80 kPa；霧化氣(GS1)壓力379.23 kPa；輔助氣(GS2)壓力344.75 kPa；目標(biāo)化合物多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 氟蟲(chóng)腈及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Spectrum parameters of fipronil and its metabolites

1.4 方法與步驟

1.4.1 樣品前處理方法

本法基于GB 23200.115—2018，對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行了改進(jìn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g雞蛋樣品(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻1 min，振蕩提取5 min，加入1 g氯化鈉和3 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋1 min，于5 000r·min-1離心5 min。準(zhǔn)確吸取1 mL上清液，轉(zhuǎn)移至含50 mg PSA粉末、50 mg C18粉末和150 mg無(wú)水硫酸鎂的2 mL離心管中，渦旋混勻30 s，于5 000 r·min-1離心5 min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4.2 方法評(píng)價(jià)

從方法的線性范圍、檢出限、定量限、回收率、精密度以及基質(zhì)效應(yīng)等方面，對(duì)建立的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定鮮雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用EXCEL 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性

配置濃度為1、5、10、50、100 μg·L-1氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物(氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈硫醚、氟甲腈)的系列溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在設(shè)定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示。依據(jù)保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的峰面積與其濃度進(jìn)行線性回歸分析，氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物在1.0～100 μg·L-1范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99 (表2)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液氟蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈硫醚、氟甲腈的UPLC-MS/MS定量離子質(zhì)譜圖(50 μg·kg-1)Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms for fipronil， fipronil sulfone， fipronil sulfide and fipronil desulfinyl in standard solution (50 μg·kg-1)

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在做定量分析時(shí)的重要影響因素之一。因此，建立方法時(shí)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行有效評(píng)價(jià)是十分必要的。通過(guò)評(píng)估了解基質(zhì)效應(yīng)的情況，尋找合適的方法削弱甚至消除基質(zhì)效應(yīng)的影響將顯著提高分析方法的可靠性。常見(jiàn)的評(píng)價(jià)方法為考察基質(zhì)校正曲線線性方程斜率與溶劑校正曲線線性方程斜率比，若兩者比值小于1，則代表基質(zhì)效應(yīng)以抑制為主；若兩者比值等于1，則代表基本無(wú)基質(zhì)效應(yīng)；若比值大于1，代表基質(zhì)以增強(qiáng)效應(yīng)為主。當(dāng)比值在0.8～1.2時(shí)，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)較弱；當(dāng)比值小于0.5或大于1.5時(shí)，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)烈[11]。本實(shí)驗(yàn)中，取空白雞蛋樣品，按樣品前處理方法進(jìn)行處理，用基質(zhì)溶液配置濃度為1、5、10、50、100 μg·L-1氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)儀器測(cè)定，按各化合物保留時(shí)間對(duì)應(yīng)的峰面積(y)與其濃度(x)進(jìn)行線性擬合。

由表2可知，本法測(cè)定鮮雞蛋中氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈砜基質(zhì)效應(yīng)呈現(xiàn)增強(qiáng)，而測(cè)定雞蛋中氟蟲(chóng)腈硫脒和氟甲腈基質(zhì)效應(yīng)呈現(xiàn)抑制。為準(zhǔn)確定量目標(biāo)化合物，減少基質(zhì)干擾，試驗(yàn)方法中采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行外標(biāo)法定量分析。

表2 氟蟲(chóng)腈及其代謝物溶劑及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液線性方程Table 2 Linear equitation of fipronil and its metabolites in standard solution and its matrix matched standard solution

2.3 方法回收率與精密度

氟蟲(chóng)腈及其3種代謝產(chǎn)物按10、20、40 μg·kg-1三個(gè)濃度分別添加至空白蛋白和蛋黃樣品中，每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣，按方法進(jìn)行樣品處理，基質(zhì)標(biāo)校準(zhǔn)正曲線定量，計(jì)算回收率與精密度。同時(shí)分別以S/N≥3、S/N≥10為判斷依據(jù)確定方法的檢出限與定量限。通過(guò)對(duì)實(shí)際鮮雞蛋樣品加標(biāo)回收檢測(cè)分析，得到加標(biāo)回收率為85.8%～105.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于11.0%(表3)。經(jīng)測(cè)算，本方法氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物的檢出限均在0.002～0.02 μg·kg-1，定量限為0.007～0.05 μg·kg-1。

表3 鮮雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物回收率及精密度Table 3 Recovery and precision of fipronil and its metabolites in fresh eggs

2.4 鮮雞蛋樣品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留污染分析

樣品采樣區(qū)域包括農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市、小區(qū)門(mén)店等，共抽取樣品30批次，開(kāi)展鮮雞蛋樣品中氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物篩查分析。分析結(jié)果表明，30批次樣品中，氟蟲(chóng)腈及其代謝物檢出1批次，殘留含量為(10.1±0.25)μg·kg-1，檢出率為3.3%。

3 討論

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有快速、高靈敏度、精準(zhǔn)定量的優(yōu)勢(shì)，尤其對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品中目標(biāo)化合物的檢測(cè)，借助液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠達(dá)到痕量分析，更好地保障食品的安全性。劉善菁等[12]建立一種液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜方法測(cè)定雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留，樣品經(jīng)提取和鹽析后，PRiME HLB凈化柱快速凈化，該方法的回收率為75%～115%，方法的定量限為0.1 μg·kg-1。壟震等[13]建立固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈亞砜、氟甲腈的分析方法，4種目標(biāo)化合物的檢測(cè)限均在0.05～0.10 μg·kg-1， 加標(biāo)回收率在80.9%～115.8%。QuEChERS技術(shù)自發(fā)明以來(lái)廣泛應(yīng)用于食品中藥物殘留分析，通常以乙腈作為提取溶劑，前處理時(shí)間短且操作過(guò)程簡(jiǎn)單[14]。本研究利用QuEChERs方法進(jìn)行前處理，建立了UPLC-MS/MS方法測(cè)定鮮雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物。該方法操作簡(jiǎn)單、快速，試驗(yàn)試劑用量少，提取效率高，氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物的檢出限均在0.002～0.02 μg·kg-1，定量限為0.007～0.05 μg·kg-1，回收率在85.8%～105.6%。該方法適用于大批量鮮雞樣品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留的快速篩查分析，可為行政機(jī)構(gòu)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

市場(chǎng)上采集的30批次鮮雞蛋樣品中，只有1批次樣品中檢出氟蟲(chóng)腈，殘留量為10.1 μg·kg-1，未超過(guò)我國(guó)限量(20 μg·kg-1)要求，但超過(guò)歐盟(5 μg·kg-1)的限量規(guī)定。蛋雞養(yǎng)殖過(guò)程中，蛋品和飼料均可能直接接觸含氟蟲(chóng)腈的消毒劑受到直接污染，如歐洲的“毒雞蛋”事件。雞蛋中農(nóng)藥殘留污染途徑還包括間接污染。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，隨著農(nóng)藥的廣泛使用，飼料用作物在種植、貯存過(guò)程中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)都可能用到殺蟲(chóng)劑，并存在通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移至蛋雞體內(nèi)沉積，在蛋品中導(dǎo)致農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)，從而對(duì)人體健康造成威脅[15]。隨著人們對(duì)畜禽產(chǎn)品的需求量越來(lái)越大，人們的食品安全意識(shí)也在不斷提高，控制蛋品中農(nóng)藥殘留污染風(fēng)險(xiǎn)尤為重要，首先，科研工作者應(yīng)積極培育和種植抗性作物，減少作物生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)藥物的依賴(lài)性；其次，蛋雞養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好生物防控，盡可能減少藥物使用；其三，行政監(jiān)管部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)農(nóng)藥管理和產(chǎn)品監(jiān)測(cè)，健全農(nóng)藥使用標(biāo)準(zhǔn)，保障生產(chǎn)源頭質(zhì)量安全。