吉小鳳，呂文濤，汪建妹，廖琳慧，徐 杰，錢鳴蓉，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質量標準研究所，浙江 杭州310021; 2.麗水市蓮都區(qū)農(nóng)業(yè)技術推廣中心， 浙江 蓮都 323000)

民以食為天，食以安為先。食品是人類賴以生存和發(fā)展的基本物質，也是人們生活中最基本的必需品。近年來，人們越來越關注殺蟲劑和其他化學物質可能會改變人類和野生動物正常的內分泌功能。內分泌干擾物可引起多種不良反應包括發(fā)育、生殖和行為危害等[1]。眾所周知，殺蟲劑對嚙齒動物和哺乳動物，包括人類具有神經(jīng)毒性[2]。

氟蟲腈屬于苯基吡唑類殺蟲劑，主要作用是通過與α-氨基丁酸受體結合，抑制氯離子通道，破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)從而殺滅昆蟲[3-5]。氟蟲腈殺蟲譜廣，可適用于水稻、玉米、棉花及其他廣泛經(jīng)濟作物的蟲害防治中，同時還適用于非農(nóng)業(yè)領域殺蟲，如可殺滅跳蚤、螨和虱[6-9]。氟蟲腈是一種化學性質活潑的化合物，在施用后，經(jīng)過水解、光解等作用，會生成3種代謝產(chǎn)物氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚和氟甲腈[6]。而經(jīng)過對代謝物毒性的研究，這三者的毒性要高于氟蟲腈原藥[7]。

世界各國已對雞蛋中氟蟲腈的殘留量制定了最大殘留限量標準(MRL)，其中，國際食品法典(CAC)和日本食品安全標準中規(guī)定，氟蟲腈在蛋中的最大殘留限量為20 μg·kg-1[8]。美國相關標準規(guī)定，氟蟲腈在蛋中的最大殘留限量為30 μg·kg-1[8]。歐盟相關標準規(guī)定，氟蟲腈在蛋中的最大殘留限量為5 μg·kg-1[8]。在保護環(huán)境和食品安全的大背景下，我國農(nóng)業(yè)部于2009年發(fā)布公告停止生產(chǎn)銷售氟蟲腈農(nóng)藥[9]，我國GB 2763—2019規(guī)定雞蛋中其最大殘留限量為20 μg·kg-1。

我國是雞蛋生產(chǎn)大國，據(jù)統(tǒng)計，2013年我國禽蛋生產(chǎn)量達到2 876萬t，人均占有量約為21 kg[10]。鮮雞蛋已漸漸成為人們每日餐桌上不可或缺的食材。歐洲“毒雞蛋”事件使得鮮雞蛋的食品安全引發(fā)消費者的關注。為了更好地了解市場上鮮雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留狀況，本文通過建立優(yōu)化的QuEChERS前處理方法結合高效液相色譜-串聯(lián)質譜法開展鮮雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留狀況分析，為鮮雞蛋質量安全科學監(jiān)管提供基礎數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟蟲腈、氟蟲腈砜、 氟蟲腈硫醚標準品(純度均大于98%，Dr.Ehrenstorfer， GmbH)；氟甲腈 (100 mg·L-1，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境科研監(jiān)測所)；乙腈(HPLC級，德國Merck公司)；甲醇(HPLC級，德國Merck公司)；甲酸(HPLC級，美國ANAQUA公司)；甲酸銨(HPLC級，北京飛美斯分析科技有限公司)；無水硫酸鈉、氯化鈉(分析級，中國凌峰化工試劑有限公司)；QuEChERS分散試劑盒含50 mg PSA，50 mg C18，150 mg無水硫酸鎂(美國Agilent公司)；實驗用水為Milli-Q純水儀制備的超純水(≥18 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(UPLC，日本島津公司)；QTRAP?6500三重四級桿-線性離子阱復合質譜儀(美國AB Sciex公司)；BS2202S電子天平(德國Sartorius公司)；SORVALL? Heraeus Biofuge冷凍高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Talboys數(shù)顯渦旋混合儀(美國Troemner公司)；超純水儀(美國Milli-Q公司)；KQ-100超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 儀器測定條件

ACQUITY UPLC C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃；進樣體積為5 μL；流動相A為甲醇，流動相B為含0.1% 甲酸和2 mmol·L-1甲酸銨的水溶液；流速為0.20 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～1 min，90%～10% B；1～4 min，10% B；4～4.1 min，10%～90% B；4.1～7 min，90% B。

離子源為電噴霧離子源(ESI)；檢測方式為多反應監(jiān)測(MRM)；掃描方式為負離子掃描；噴霧電壓(IS)：-4 500 V；離子源溫度(TEM)500 ℃；氣簾氣(CUR)壓力275.80 kPa；霧化氣(GS1)壓力379.23 kPa；輔助氣(GS2)壓力344.75 kPa；目標化合物多反應監(jiān)測參數(shù)見表1。

表1 氟蟲腈及其代謝物質譜參數(shù)Table 1 Spectrum parameters of fipronil and its metabolites

1.4 方法與步驟

1.4.1 樣品前處理方法

本法基于GB 23200.115—2018，對樣品前處理方法進行了改進。準確稱取2 g雞蛋樣品(精確至0.01 g)置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻1 min，振蕩提取5 min，加入1 g氯化鈉和3 g無水硫酸鈉，渦旋1 min，于5 000r·min-1離心5 min。準確吸取1 mL上清液，轉移至含50 mg PSA粉末、50 mg C18粉末和150 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中，渦旋混勻30 s，于5 000 r·min-1離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

1.4.2 方法評價

從方法的線性范圍、檢出限、定量限、回收率、精密度以及基質效應等方面，對建立的超高效液相色譜-質譜聯(lián)用測定鮮雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的方法進行評價。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用EXCEL 2010對試驗數(shù)據(jù)進行分析，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 線性

配置濃度為1、5、10、50、100 μg·L-1氟蟲腈及其3種代謝物(氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚、氟甲腈)的系列溶劑標準溶液及基質標準溶液，在設定的色譜和質譜條件下進行測定，標準溶液色譜圖如圖1所示。依據(jù)保留時間對應的峰面積與其濃度進行線性回歸分析，氟蟲腈及其3種代謝物在1.0～100 μg·L-1范圍內線性良好，相關系數(shù)(R2)均大于0.99 (表2)。

圖1 標準溶液氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈硫醚、氟甲腈的UPLC-MS/MS定量離子質譜圖(50 μg·kg-1)Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms for fipronil， fipronil sulfone， fipronil sulfide and fipronil desulfinyl in standard solution (50 μg·kg-1)

2.2 基質效應

基質效應是液相色譜-串聯(lián)質譜法在做定量分析時的重要影響因素之一。因此，建立方法時對基質效應進行有效評價是十分必要的。通過評估了解基質效應的情況，尋找合適的方法削弱甚至消除基質效應的影響將顯著提高分析方法的可靠性。常見的評價方法為考察基質校正曲線線性方程斜率與溶劑校正曲線線性方程斜率比，若兩者比值小于1，則代表基質效應以抑制為主；若兩者比值等于1，則代表基本無基質效應；若比值大于1，代表基質以增強效應為主。當比值在0.8～1.2時，說明基質效應較弱；當比值小于0.5或大于1.5時，說明基質效應強烈[11]。本實驗中，取空白雞蛋樣品，按樣品前處理方法進行處理，用基質溶液配置濃度為1、5、10、50、100 μg·L-1氟蟲腈及其3種代謝物的系列標準溶液，經(jīng)儀器測定，按各化合物保留時間對應的峰面積(y)與其濃度(x)進行線性擬合。

由表2可知，本法測定鮮雞蛋中氟蟲腈和氟蟲腈砜基質效應呈現(xiàn)增強，而測定雞蛋中氟蟲腈硫脒和氟甲腈基質效應呈現(xiàn)抑制。為準確定量目標化合物，減少基質干擾，試驗方法中采用基質標準溶液進行外標法定量分析。

表2 氟蟲腈及其代謝物溶劑及基質標準溶液線性方程Table 2 Linear equitation of fipronil and its metabolites in standard solution and its matrix matched standard solution

2.3 方法回收率與精密度

氟蟲腈及其3種代謝產(chǎn)物按10、20、40 μg·kg-1三個濃度分別添加至空白蛋白和蛋黃樣品中，每個濃度做6個平行樣，按方法進行樣品處理，基質標校準正曲線定量，計算回收率與精密度。同時分別以S/N≥3、S/N≥10為判斷依據(jù)確定方法的檢出限與定量限。通過對實際鮮雞蛋樣品加標回收檢測分析，得到加標回收率為85.8%～105.6%，相對標準偏差均小于11.0%(表3)。經(jīng)測算，本方法氟蟲腈及其3種代謝物的檢出限均在0.002～0.02 μg·kg-1，定量限為0.007～0.05 μg·kg-1。

表3 鮮雞蛋中氟蟲腈及其代謝物回收率及精密度Table 3 Recovery and precision of fipronil and its metabolites in fresh eggs

2.4 鮮雞蛋樣品中氟蟲腈及其代謝物殘留污染分析

樣品采樣區(qū)域包括農(nóng)貿市場、超市、小區(qū)門店等，共抽取樣品30批次，開展鮮雞蛋樣品中氟蟲腈及其3種代謝物篩查分析。分析結果表明，30批次樣品中，氟蟲腈及其代謝物檢出1批次，殘留含量為(10.1±0.25)μg·kg-1，檢出率為3.3%。

3 討論

液相色譜質譜聯(lián)用技術具有快速、高靈敏度、精準定量的優(yōu)勢，尤其對于復雜基質樣品中目標化合物的檢測，借助液相色譜質譜聯(lián)用技術能夠達到痕量分析，更好地保障食品的安全性。劉善菁等[12]建立一種液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜方法測定雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留，樣品經(jīng)提取和鹽析后，PRiME HLB凈化柱快速凈化，該方法的回收率為75%～115%，方法的定量限為0.1 μg·kg-1。壟震等[13]建立固相萃取-高效液相色譜法測定雞蛋中氟蟲腈及其代謝物氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、氟甲腈的分析方法，4種目標化合物的檢測限均在0.05～0.10 μg·kg-1， 加標回收率在80.9%～115.8%。QuEChERS技術自發(fā)明以來廣泛應用于食品中藥物殘留分析，通常以乙腈作為提取溶劑，前處理時間短且操作過程簡單[14]。本研究利用QuEChERs方法進行前處理，建立了UPLC-MS/MS方法測定鮮雞蛋中氟蟲腈及其3種代謝物。該方法操作簡單、快速，試驗試劑用量少，提取效率高，氟蟲腈及其3種代謝物的檢出限均在0.002～0.02 μg·kg-1，定量限為0.007～0.05 μg·kg-1，回收率在85.8%～105.6%。該方法適用于大批量鮮雞樣品中氟蟲腈及其代謝物殘留的快速篩查分析，可為行政機構農(nóng)產(chǎn)品質量安全監(jiān)管提供技術支撐。

市場上采集的30批次鮮雞蛋樣品中，只有1批次樣品中檢出氟蟲腈，殘留量為10.1 μg·kg-1，未超過我國限量(20 μg·kg-1)要求，但超過歐盟(5 μg·kg-1)的限量規(guī)定。蛋雞養(yǎng)殖過程中，蛋品和飼料均可能直接接觸含氟蟲腈的消毒劑受到直接污染，如歐洲的“毒雞蛋”事件。雞蛋中農(nóng)藥殘留污染途徑還包括間接污染。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，隨著農(nóng)藥的廣泛使用，飼料用作物在種植、貯存過程中的任何一個環(huán)節(jié)都可能用到殺蟲劑，并存在通過食物鏈轉移至蛋雞體內沉積，在蛋品中導致農(nóng)藥殘留的風險，從而對人體健康造成威脅[15]。隨著人們對畜禽產(chǎn)品的需求量越來越大，人們的食品安全意識也在不斷提高，控制蛋品中農(nóng)藥殘留污染風險尤為重要，首先，科研工作者應積極培育和種植抗性作物，減少作物生長過程中對藥物的依賴性；其次，蛋雞養(yǎng)殖企業(yè)應加強飼養(yǎng)管理，做好生物防控，盡可能減少藥物使用；其三，行政監(jiān)管部門應加強農(nóng)藥管理和產(chǎn)品監(jiān)測，健全農(nóng)藥使用標準，保障生產(chǎn)源頭質量安全。