張惠婷

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

多肽是具有特定氨基酸序列的生物活性物質(zhì)[1]，其消化吸收率及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值均優(yōu)于蛋白質(zhì)或氨基酸，且其所具有的生理功能氨基酸無(wú)法比擬[2]，因此其也被稱作為生物活性肽。生物活性肽的種類較多、分布較廣[3]、食用安全性極高[4]，它不但能夠提供機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還具有抗高血壓、調(diào)節(jié)免疫、抗細(xì)菌等多種功能[5]。將大分子的蛋白質(zhì)酶解成小分子的多肽，不但能夠提高蛋白質(zhì)的消化利用率，而且還能得到不同功能的生物活性肽。

目前，生物活性肽常用的制備方法為酶解法[6]。在選擇利用酶解法制備生物活性肽時(shí)，挑選富含蛋白質(zhì)的原料進(jìn)行酶解十分關(guān)鍵?？O蟶在福建又稱蟶子，其資源豐富[7]，分布廣泛，富含蛋白質(zhì)[8]，在生物活性肽的研究方面具有極大的潛力。以資源豐富、富含蛋白質(zhì)的縊蟶為原料制備生物活性肽，不但能夠充分地利用縊蟶蛋白，有效地發(fā)揮縊蟶存在的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還能夠充分利用縊蟶資源，具有極大的市場(chǎng)發(fā)展空間。

利用酶解法制備生物活性肽時(shí)，不同種類酶的選擇可以得到不同的多肽。TPCK-胰蛋白酶是一種特異性的肽鏈內(nèi)切酶，能夠?qū)Ｒ恍缘厍懈畹鞍追肿又芯彼幔ˋrg）、賴氨酸（Lys）位點(diǎn)[9]。采用具有專一性酶切位點(diǎn)的TPCK-胰蛋白酶對(duì)縊蟶蛋白進(jìn)行酶解，可得到具有特定C末端殘基的肽段。在酶解過(guò)程中對(duì)酶解工藝條件的控制，很大程度上影響酶解的效果。因此，本試驗(yàn)采用TPCK-胰蛋白酶對(duì)鮮縊蟶肉進(jìn)行酶解，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝條件，為今后進(jìn)一步研究制備縊蟶多肽提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

鮮活縊蟶：購(gòu)于福建福州永輝超市；

TPCK-胰蛋白酶：購(gòu)于上海國(guó)源生物技術(shù)有限公司，酶活性為1.1萬(wàn)U/mg（反應(yīng)溫度：37 ℃）；

Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備

PB-10型pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；

TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；

BS 224S型電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 技術(shù)路線

鮮活縊蟶→去殼取鮮肉絞碎→酶解→滅酶→酶解液離心→取上清液→測(cè)定多肽含量

2.2 多肽提取量測(cè)定

凡具有兩個(gè)直接連接的肽鍵都有雙縮脲反應(yīng)[10]。因此，本文酶解液中多肽提取量的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[11,12]中的雙縮脲測(cè)定法，并作適當(dāng)修改。具體測(cè)定方法如下：

2.2.1 四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用5%（W/V）的三氯乙酸分別配制濃度梯度為0.0～1.0 mg/mL的四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，將不同濃度的四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液與雙縮脲試劑按體積比3∶2加入試管中，搖勻靜置離心，取上清液測(cè)定OD值（540 nm）。

2.2.2 提取量測(cè)定

稱取去殼的鮮縊蟶肉進(jìn)行酶解，經(jīng)滅酶、冷卻后，將酶解產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容離心獲得上清液Ⅰ。取上清液Ⅰ與等體積的10%（W/V）三氯乙酸水溶液混合均勻，靜置離心獲得上清液Ⅱ。取上清液Ⅱ，用5%（W/V）的三氯乙酸水溶液定容于25 mL容量瓶中，獲得樣品溶液Ⅲ。將樣品溶液Ⅲ與雙縮脲試劑按體積比3∶2加入試管中，搖勻靜置離心，取上清液測(cè)定OD值（540 nm）。通過(guò)所得的四肽回歸方程，計(jì)算樣品溶液Ⅲ中多肽的質(zhì)量濃度C（mg/mL）。以下為多肽提取量的計(jì)算公式：

式中：

M表示多肽提取量，即每克新鮮縊蟶肉酶解得到的多肽毫克數(shù)，mg/g；

C為樣品溶液Ⅲ中多肽的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V1為所吸取的上清液Ⅱ的體積，mL；

V2為樣品溶液Ⅲ的體積，mL；

m為所稱取新鮮縊蟶肉的質(zhì)量，g；

2表示等體積的Ⅰ溶液與10%（W/V）的三氯乙酸水溶液混合后體積擴(kuò)大的倍數(shù)。

2.3 TPCK-胰蛋白酶酶解工藝研究

2.3.1 TPCK-胰蛋白酶酶解工藝的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量新鮮的去殼縊蟶肉，以pH=7.8的緩沖溶液作為反應(yīng)液，在水浴溫度37 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，分別考察酶解時(shí)間1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h、料液比1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0、1∶5.0、1∶6.0和酶添加量4500、9000、13500、18000、22500 U/g對(duì)多肽提取量的影響。按2.2.2的方法測(cè)定多肽提取量。

2.3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)選TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 TPCK-胰蛋白酶酶解正交試驗(yàn)因素及水平

3 結(jié)果與分析

3.1 四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按本文2.2.1方法，得四肽質(zhì)量濃度（X）與其光密度（Y）之間的回歸方程為：Y=0.1443X+0.0017，R2=0.9998，變量X的范圍落在0～1 mg/mL之間。

3.2 TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝研究及其優(yōu)化

3.2.1 酶解時(shí)間對(duì)TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影響

稱取5 g新鮮去殼縊蟶肉，用pH值為7.8的緩沖溶液作為反應(yīng)液，酶添加量為2250 U/g，料液比為1∶3.0，酶解溫度為37℃條件下，分別酶解1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h，酶解結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，酶解時(shí)間在1.0～5.0 h之間時(shí)，多肽提取量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。當(dāng)酶解時(shí)間為2.0 h左右時(shí)，多肽提取量達(dá)到單因素試驗(yàn)的最高水平。而當(dāng)酶解時(shí)間大于5.0 h時(shí)，多肽提取量基本保持不變。這可能是由于TPCK-胰蛋白酶是一種特異性比較強(qiáng)的內(nèi)切酶，隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液中已沒(méi)有適合TPCK-胰蛋白酶作用位點(diǎn)的肽段。因此多肽提取量最終趨于平衡不變的趨勢(shì)。綜上，酶解的時(shí)間選擇為2.0 h左右較為適合。

3.2.2 料液比對(duì)TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影響 稱取5 g新鮮去殼的縊蟶肉，用pH值為7.8的緩沖溶液作為反應(yīng)液，酶的添加量為2250 U/g，酶解溫度為37 ℃條件下，分別按料液比1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0、1∶5.0、1∶6.0酶解2.0 h，酶解結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，料液比從1∶1.0擴(kuò)大至1∶6.0，多肽提取量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶3.0時(shí)，多肽提取量達(dá)到單因素試驗(yàn)的最高水平。當(dāng)料液比大于1∶3.0時(shí)，反應(yīng)體系中溶液的增多，減少了TPCK-胰蛋白酶與底物蛋白碰撞接觸的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致多肽提取量下降。因此，料液比選取在1∶3.0左右。

3.2.3 酶添加量對(duì)TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影響 稱取5g新鮮的去殼縊蟶肉，用pH值為7.8的緩沖溶液作為反應(yīng)液，酶解溫度為37 ℃，料液比為1∶3.0，酶添加量為4500、9000、13500、18000、22500 U/g條件下，分別酶解2.0 h，酶解結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨酶添加量的增加，多肽提取量也相應(yīng)增加。當(dāng)酶添加量為18000 U/g時(shí)，多肽提取量達(dá)到單因素試驗(yàn)的最高水平。當(dāng)酶添加量大于18000 U/g時(shí)，多肽提取量反而開(kāi)始降低。這可能是由于TPCK-胰蛋白酶將縊蟶蛋白反應(yīng)完全后，酶解液中還有適合酶切位點(diǎn)的肽段，TPCK-胰蛋白酶對(duì)這些肽段進(jìn)行酶解，使之降解成游離氨基酸，導(dǎo)致多肽提取量降低。綜上，TPCK-胰蛋白酶的酶添加量選擇為18000 U/g左右。

3.2.4 TPCK-胰蛋白酶酶解工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)對(duì)表2中極差R值進(jìn)行比較可知，本試驗(yàn)的3個(gè)因素對(duì)多肽提取量影響的主次順序?yàn)椋篈＞B＞C，即酶添加量的影響最大，酶解時(shí)間的影響最小。由K值比較得最優(yōu)水平為：A2B3C2。

應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)表2所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，分析的結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，本試驗(yàn)所選取的3個(gè)因素對(duì)多肽提取量的影響順序?yàn)椋篈＞B＞C，與表2極差分析的結(jié)果相一致。由方差分析結(jié)果可知，本試驗(yàn)3個(gè)因素對(duì)縊蟶多肽提取量都具有顯著的影響。其中，A因素即酶的添加量的影響極顯著。綜合極差分析與方差分析的結(jié)果，選擇A2B3C2為最優(yōu)組合。

表2 TPCK-胰蛋白酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 TPCK-胰蛋白酶酶解正交試驗(yàn)方差分析

以優(yōu)化所得的組合A2B3C2進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，在最優(yōu)組合下，縊蟶多肽的平均提取量可達(dá)（71.6±0.4）mg/g，表明該酶解工藝優(yōu)化成功。

4 結(jié)論

本研究以多肽提取量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的工藝條件，結(jié)果表明：

TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的最佳酶解工藝為：pH=7.8、酶添加量18000 U/g、料液比（m∶V）為1∶3.5、酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間2.0 h。在此最優(yōu)酶解的工藝條件下，每克去殼鮮縊蟶肉可提?。?1.6±0.4）mg多肽。在對(duì)TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的工藝條件進(jìn)行顯著性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)酶添加量、料液比、酶解時(shí)間對(duì)TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的效果都具有顯著影響，因此在TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的過(guò)程中，應(yīng)注意酶添加量、料液比、酶解時(shí)間的控制。