李靖雯，陳 嫣，趙自寬，劉 威，崔 簫，翁加玉，徐亞華，韋 偉，王興國(guó)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫 214122)

母乳含有嬰幼兒發(fā)育必需的各種營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)、發(fā)育非常重要。母乳中的脂肪為嬰兒提供了約50%的能量[1]。在模擬母乳脂肪配方中，脂肪酸組成一直是研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外的研究不僅聚焦于母乳脂肪酸組成、含量以及其中的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸對(duì)嬰幼兒健康的影響，也關(guān)注母乳中脂肪酸在甘油三酯中的位置分布不同對(duì)嬰幼兒消化吸收的影響。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于母乳中脂肪消化特性的研究尚不全面。體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)存在費(fèi)用高、周期長(zhǎng)、結(jié)果重現(xiàn)性差、倫理譴責(zé)等問(wèn)題[2]，體外模型用于模擬體內(nèi)消化能夠體現(xiàn)消化過(guò)程中的一些細(xì)節(jié)，能夠與體內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，并且具有靈活性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)[3]。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者采用體外消化模型對(duì)乳脂肪球結(jié)構(gòu)、初始粒徑與界面結(jié)構(gòu)等物理因素對(duì)于消化特性的影響進(jìn)行了研究[4]，這對(duì)于嬰兒配方奶粉的加工過(guò)程控制具有重要意義。同時(shí)，配方奶粉的成分控制也是十分必要的，通過(guò)研究母乳脂肪的消化特性以改善奶粉中的脂肪球結(jié)構(gòu)與成分，并提升其功能性。對(duì)于早產(chǎn)兒這一群體，為使配方奶粉更具針對(duì)性，應(yīng)使脂肪球結(jié)構(gòu)與成分滿足早產(chǎn)兒的相應(yīng)需求。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)模擬早產(chǎn)兒體外消化母乳脂肪的過(guò)程來(lái)分析人乳脂肪的脂肪酸組成，并研究消化過(guò)程中成分的變化，從而為早產(chǎn)兒配方奶粉的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

兔胃脂肪酶，從6～8周的安哥拉長(zhǎng)毛兔的兔胃中提取，安哥拉長(zhǎng)毛兔在江蘇大豐市春喜兔毛加工廠宰殺后立即摘取兔胃，放置于干冰中運(yùn)輸，在實(shí)驗(yàn)室中于-80℃冰箱中儲(chǔ)存，直至進(jìn)一步脂肪酶提取純化[5]，酶活為0.35 U/mg。豬胰脂肪酶與牛膽汁鹽均購(gòu)于上海Sigma-Aldrich公司，以三丁酸甘油酯為底物，pH 6.2下測(cè)得豬胰脂肪酶的酶活為2.7 U/mg。

母乳取自5名在無(wú)錫婦幼保健院分娩健康早產(chǎn)兒的產(chǎn)后1個(gè)月的母親，研究對(duì)象排除標(biāo)準(zhǔn)為：高血壓，糖尿病，煙、酒、毒麻藥嗜好者，甲狀腺患者，素食者，遺傳或腫瘤家族史人群，在2個(gè)月內(nèi)使用抗生素者。將收集的母乳于-80℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)放于4℃冰箱中保持16 h以上解凍，將所有母乳混合，然后分裝成35 mL/袋，于-20℃下儲(chǔ)存直至用于消化實(shí)驗(yàn)。

分析純乙醚、石油醚、丙酮、乙醇、甲醇、氨水、氫氧化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、氯化鈉、氯化鈣、酚酞指示劑，均購(gòu)于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；色譜純正己烷，美國(guó)Fisher公司；37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

Agilent 7820氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司； MixPlus旋渦振蕩儀，合肥艾本森儀器有限公司；AR2140電子天平和FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司； WHY-2數(shù)顯恒溫振蕩器，上海梅香儀器有限公司；三口夾層反應(yīng)釜，玻璃廠定制；RT 10多點(diǎn)磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司；BQ 100-1A蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器，慧宇偉業(yè)(北京)流體設(shè)備有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 早產(chǎn)兒體外動(dòng)態(tài)消化模型

腸轉(zhuǎn)運(yùn)和胃排空速度遵循由數(shù)學(xué)模型擬合的指數(shù)模型[9]，由母乳喂養(yǎng)的早產(chǎn)新生兒的擬合數(shù)據(jù)決定[10]，Oliveira等[6]預(yù)估早產(chǎn)兒胃排空和腸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行一半的時(shí)間分別為36 min和220 min。在Elashoff模型基礎(chǔ)上設(shè)定早產(chǎn)兒消化的胃排空梯度，見(jiàn)表1。同時(shí)對(duì)早產(chǎn)兒消化的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)梯度劃分進(jìn)行參數(shù)重置，見(jiàn)表2。隨著消化時(shí)間的推移，早產(chǎn)兒的胃室pH不斷改變，根據(jù)Mason[11]在臨床上測(cè)得的新生兒空腹及攝食2 h內(nèi)的胃室pH變化曲線對(duì)其進(jìn)行梯度劃分，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 早產(chǎn)兒消化的胃排空梯度

表2 早產(chǎn)兒消化的小腸轉(zhuǎn)運(yùn)梯度

表3 早產(chǎn)兒消化的胃室pH梯度

1.2.2 母乳脂肪的消化

體外模擬早產(chǎn)兒胃-小腸消化流程如圖1所示。

注：1～9.蠕動(dòng)泵；201.胃液試劑瓶；202.胰液試劑瓶；203.膽汁試劑瓶；204.鹽酸試劑瓶；205.氫氧化鈉試劑瓶；206.乙醇試劑瓶；301.胃消化室；302.小腸消化室；306.循環(huán)水浴鍋；400、401.磁力攪拌器；600.系統(tǒng)控制器；801、802.pH計(jì)。

如圖1所示：母乳脂肪在早產(chǎn)兒體外模擬胃-小腸消化，具體操作為，開(kāi)啟恒溫水浴鍋，使整個(gè)消化體系溫度恒定于37℃；初始時(shí)胃、小腸消化室內(nèi)pH與所加溶液參考前述空腹?fàn)顟B(tài)各項(xiàng)參數(shù)。將35 mL早產(chǎn)兒母乳加入到胃消化室，同時(shí)設(shè)置部分設(shè)備參數(shù)：①將磁力攪拌器設(shè)置為間歇模式，轉(zhuǎn)速為100 r/min；②開(kāi)啟酸泵和堿泵，在維持小腸消化室pH 6.2的同時(shí)實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)胃消化室的pH；③開(kāi)啟胃液泵并調(diào)節(jié)加入胃液與脂肪酶的混合液的速度為1 mL/min，保持上述條件10 min。真正的消化過(guò)程為食物經(jīng)胃排空后經(jīng)腸轉(zhuǎn)運(yùn)，因此設(shè)置： ①將胃液泵速調(diào)至0.5 mL/min；②分別設(shè)置膽汁泵和胰液泵加液速度為0.5 mL/min和0.25 mL/min。在母乳樣品被消化0、30、60、90 min和120 min之后，分別收集胃液和腸液樣本，每次取樣后立即用適量6 mol/L的濃鹽酸滅酶，并立即提取脂肪以防止各類脂質(zhì)相互轉(zhuǎn)化。每個(gè)母乳樣品重復(fù)進(jìn)行上述操作3次。

1.2.3 脂肪提取

參照Barbano等[12]在AOAC 995.19基礎(chǔ)改進(jìn)的方法。具體如下：將5 mL母乳和1 mL氨水混合后于(65±5)℃水浴中，振蕩均勻后取出。依次加入5 mL乙醇、12.5 mL乙醚和12.5 mL石油醚，搖勻，靜置分層。倒出上清液后，加入劑量減半的乙醇、石油醚和乙醚進(jìn)行第二次提取。將兩次得到的提取液合并，用氮?dú)獯抵梁阒匾垣@取脂肪。將獲取的脂肪在-20℃條件下儲(chǔ)存以待下一步分析。

1.2.4 脂類組成的測(cè)定及脂解程度的計(jì)算

參照徐亞華[5]的方法測(cè)定消化液的脂類組成。

消化液中含有的脂質(zhì)包括殘余的甘油三酯(TAG)、水解產(chǎn)物甘油二酯(DAG)、甘油單酯(MAG)以及游離脂肪酸(FFA)，通過(guò)對(duì)相應(yīng)時(shí)刻下母乳脂肪酸組成的檢測(cè)可得到各脂肪酸的質(zhì)量數(shù)據(jù)，計(jì)算出相應(yīng)的平均摩爾質(zhì)量，將其轉(zhuǎn)化成摩爾數(shù)。消化過(guò)程某一時(shí)刻的脂解程度(D)用FFA占?xì)堄喔视王ブ锌傰；溂癋FA的摩爾分?jǐn)?shù)表示，即：

D=cFFA/(3×cTAG+2×cDAG+cMAG+cFFA)×100%

(1)

式中：cFFA、cTAG、cDAG和cMAG為各類脂質(zhì)的濃度，mol/mL。

1.2.5 脂肪酸組成的測(cè)定

快速甲醇法甲酯化[13]：取一定油樣,加入正己烷,充分振蕩使其溶解。加入氫氧化鉀-甲醇溶液，用旋渦振蕩儀使其充分混合后，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，在10 000 r/min的條件下離心3 min，取上層清液，進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。

氣相色譜條件參考梁麗[4]的方法：FID檢測(cè)器；色譜柱為T(mén)race TR-FAME毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序?yàn)槌跏贾鶞?0℃，維持3 min，先以5℃/min升至175℃后維持15 min，再以2℃/min升至220℃，保持10 min；分流比100∶1；載氣為氮?dú)?，流?.2 mL/min；檢測(cè)器與進(jìn)樣口溫度均為250℃。

通過(guò)比較樣品中包含的脂肪酸甲酯與37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時(shí)間確定脂肪酸的組成，通過(guò)面積歸一化法定量。

1.2.6 FFA和sn-2位MAG組成的測(cè)定

采用硅膠薄層層析板分離消化所得的脂類混合物，sn-2 MAG(2-MAG)展開(kāi)劑采用正己烷-乙醚-乙酸(體積比50∶50∶1)，F(xiàn)FA展開(kāi)劑采用正己烷-乙醚-乙酸(體積比70∶30∶2)。分別刮下2-MAG和FFA條帶，用無(wú)水乙醚提取兩遍后進(jìn)行氮吹，然后進(jìn)行甲酯化處理與氣相色譜測(cè)定，方法同1.2.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂解動(dòng)力學(xué)

在整個(gè)模擬母乳脂肪體外消化過(guò)程中的脂解動(dòng)力學(xué)情況如圖2所示。

由圖2a可知，母乳在胃中進(jìn)行的脂解過(guò)程與在小腸中進(jìn)行的脂解過(guò)程速率差異明顯。在胃環(huán)境中，脂解程度僅表現(xiàn)出輕微上升，且到60 min后脂解程度基本不再變化，120 min時(shí)脂解程度為(7.03±0.15)%，這種現(xiàn)象是由于母乳在脂解過(guò)程中會(huì)釋放出大量長(zhǎng)鏈脂肪酸，其會(huì)在乳狀液的外表面形成包裹脂肪酶的顆粒，進(jìn)而對(duì)脂肪酶產(chǎn)生抑制作用，直接影響母乳的脂解速率。與胃環(huán)境中的平緩變化趨勢(shì)相比，母乳在小腸中的脂解程度成急劇上升趨勢(shì)，在120 min時(shí)脂解程度為(37.22±1.43)%，增幅超20個(gè)百分點(diǎn)。以上結(jié)果表明，腸道為母乳脂質(zhì)在嬰兒消化道的主要消化器官。

由圖2b可知，體外消化過(guò)程中，母乳的脂解產(chǎn)物中TAG、DAG、MAG和FFA的含量變化與脂解程度的變化趨勢(shì)相符。在2 h的胃環(huán)境消化過(guò)程中，脂類組成無(wú)明顯變化，未產(chǎn)生MAG。然而在小腸環(huán)境中，隨著消化過(guò)程的進(jìn)行，TAG含量不斷降低，以FFA為主的產(chǎn)物含量不斷增加。腸道消化2 h后仍會(huì)保留15%左右的TAG形式的脂質(zhì)。

2.2 母乳樣品的脂肪酸組成

母乳樣品的主要脂肪酸組成如表4所示。由表4可知，C16∶0與C18∶1n-9總含量大于50%，另外C18∶2n-6、C18∶0、C14∶0和C12∶0含量也較高。

表4 母乳樣品主要脂肪酸組成

2.3 模擬胃和小腸消化母乳脂肪過(guò)程中釋放出的FFA組成

母乳脂肪中的初始脂肪酸組成與經(jīng)過(guò)模擬胃與小腸的消化環(huán)境消化后得到的FFA組成之間的差異如圖3所示。

由圖3可知，在整個(gè)模擬胃腸道體外消化過(guò)程中，C18∶1n-9與C18∶2n-6是脂解的主要產(chǎn)物。C18∶1n-9與C18∶2n-6的含量遠(yuǎn)高于其在初始母乳脂肪中含量，其中在胃消化階段，分別增加了13.11、12.63個(gè)百分點(diǎn)，在小腸消化階段，分別增加了17.4、12.63個(gè)百分點(diǎn)，且C16∶1n-7、C18∶3n-3、C20∶3n-6和C20∶4n-6的含量均顯示出相同變化趨勢(shì)。另外兩種次主要脂解產(chǎn)物C16∶0和C18∶0的含量在胃消化階段則分別下降了16.05、2.84個(gè)百分點(diǎn)，C10∶0、C12∶0、C14∶0和C22∶6n-3的含量與C16∶0、C18∶0的變化趨勢(shì)大體相同。

在小腸消化環(huán)境中，呈游離態(tài)存在的C16∶0含量低于胃環(huán)境，相反，游離態(tài)的C10∶0含量高于胃環(huán)境，其他的脂肪酸產(chǎn)物在小腸環(huán)境中的釋放量的變化趨勢(shì)則與胃環(huán)境中的大致相同。

2.4 模擬小腸消化母乳脂肪過(guò)程中釋放出的2-MAG脂肪酸組成

母乳脂肪中的初始脂肪酸組成與經(jīng)過(guò)模擬小腸消化母乳脂肪過(guò)程中釋放出的2-MAG脂肪酸組成見(jiàn)圖4。

由圖4可知，母乳脂肪初始脂肪酸組成和腸內(nèi)脂解產(chǎn)物2-MAG的脂肪酸組成存在較大差異。在小腸階段釋放出2-MAG的主要成分為C16∶0、C14∶0、C18∶1n-9和C18∶2n-6。小腸內(nèi)脂解產(chǎn)物2-MAG中的C14∶0、C16∶0、C20∶0以及C22∶6n-3的含量均明顯高于其在母乳脂肪初始脂肪酸中的含量，其中C16∶0的含量最高，變化也最為明顯，差值在30個(gè)百分點(diǎn)左右，再結(jié)合胃脂肪酶(sn-3位)和胰脂肪酶(sn-1,3位)的作用位點(diǎn)特異性，可得到C16∶0主要分布在sn-2位的結(jié)論，而C10∶0、C18∶1n-7、C18∶1n-9、C18∶2n-6、C18∶3n-3以及C20∶3n-6等脂肪酸的含量均明顯低于其在母乳脂肪初始脂肪酸中的含量，即這些脂肪酸主要分布在sn-1,3位。

另外，結(jié)合圖3和圖4可知，消化時(shí)間不作為影響母乳脂肪在體內(nèi)消化過(guò)程中釋放出產(chǎn)物FFA或2-MAG 的脂肪酸組成變化的主要因素，對(duì)于整個(gè)脂解過(guò)程，酶依舊是起主要調(diào)控作用的物質(zhì)，與酶自身具有的特性一致，脂肪酶的專一性和特異性在該過(guò)程中尤為重要，不僅僅體現(xiàn)在作用物質(zhì)上，還包括作用位點(diǎn)的絕對(duì)控制，即胃脂肪酶對(duì)sn-3位的作用和胰脂肪酶對(duì)sn-1,3位的作用。

3 結(jié) 論

小腸是嬰兒進(jìn)行脂類物質(zhì)消化的主要器官，從早產(chǎn)兒胃環(huán)境至小腸環(huán)境，母乳脂肪120 min時(shí)脂解程度從(7.03±0.15)%增加至(37.22±1.43)%。母乳脂肪在胃腸消化過(guò)程中釋放出FFA的主要成分是C18∶1n-9和C18∶2n-6，其次是C16∶0，在小腸消化階段釋放出2-MAG的主要成分為C16∶0、C14∶0、C18∶1n-9和C18∶2n-6。模擬早產(chǎn)兒胃腸道消化環(huán)境的體外消化模型的建立，有助于研究隨著時(shí)間變化，早產(chǎn)兒胃腸道的消化進(jìn)程以及相關(guān)物質(zhì)組分及其含量，為更多針對(duì)性的早產(chǎn)兒配方食品的研發(fā)提供基礎(chǔ)。