董瑩瑩，胡重怡，葉 航，朱啟盛，朱作為，郭 平，張文中，王 棟

(1.江西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院,南昌330045； 2.江西省食品檢驗檢測研究院，南昌 330001；3.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院，南寧 530002； 4.江西齊云山油茶科技有限公司，江西 贛州 341000)

油茶籽油，又名山茶油、茶油，其脂肪酸組成與“液體黃金”橄欖油尤為相似[1-2]，其還富含角鯊烯、甾醇等三萜類化合物。三萜類化合物對人體的營養(yǎng)保健起著重要的作用，如具有降低血清膽固醇水平，預防心臟病及抗炎、抗癌等作用[3-5]。目前，油茶籽油三萜類化合物研究大多集中在菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇等幾種常見甾醇，而對其他三萜類化合物并未深入研究[6]。為關注油茶籽油精煉加工過程中三萜類化合物含量變化，本研究以正己烷為洗脫劑，采用中性氧化鋁柱層析提取分離不同精煉工序油茶籽油中三萜類化合物，并利用GC-MS測定不同精煉工序的油茶籽油中三萜類化合物含量，研究精煉過程對三萜類化合物含量的影響，對全面認識油茶籽油的營養(yǎng)具有重要意義，并為后續(xù)開展油茶籽油適度精煉提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

油茶籽浸出毛油及其脫酸油、脫色油、脫臭油、成品油，各6批次，由江西齊云山油茶科技有限公司提供。

角鯊烯、膽甾烷醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、β-香樹脂醇、羽扇豆醇、環(huán)阿屯醇、熊果醇、樺木醇、無水嘧啶，美國Sigma公司；羊毛甾醇，美國Avanti公司；中性氧化鋁(薄層用，F(xiàn)CP200～300目)；氫氧化鉀、無水乙醇，分析純；正己烷，色譜純，美國Honeywell公司；0.22 μm濾膜，日本Shimadzu公司；99∶1雙三甲基硅基三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷(99∶1 BSTFA-TMCS)，美國TCI公司。

1.1.2 儀器與設備

7890B+7000D氣相色譜-三重四級桿串接質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；QUINTIX124-1CN電子分析天平(精度≤0.1 mg)，德國賽多利斯公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；Vortex Wizard渦旋儀，意大利VELP公司；N-EVAP氮吹儀，美國Organomation公司；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，瑞士Buchi公司；層析柱、冷凝回流管、圓底燒瓶、玻璃試管，四川蜀玻有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

用丙酮分別配制1 mg/mL角鯊烯、菜籽甾醇、菜油甾醇、膽甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、β-香樹脂醇、環(huán)阿屯醇、羽扇豆醇、熊果醇、羊毛甾醇、樺木醇母液。樣品測定時，根據(jù)油茶籽油中實際三萜類化合物濃度，在各三萜類化合物線性范圍內(nèi)將母液配制成分別含有0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL豆甾醇、羽扇豆醇、樺木醇、熊果醇、菜籽甾醇、菜油甾醇，2、5、10、20、50、100 μg/mL角鯊烯、β-谷甾醇、羊毛甾醇，10、25、50、100、250、500 μg/mL環(huán)阿屯醇、β-香樹脂醇6個梯度的不同質(zhì)量濃度混標，混標中加入100 μL內(nèi)標(1 mg/mL膽甾烷醇)。氮吹后加入100 μL硅烷化試劑(99∶1 BSTFA-TMCS和等體積無水嘧啶)衍生試劑，室溫放置15 min，加入1 500 μL正己烷稀釋，過0.22 μm有機濾膜，進氣相色譜-質(zhì)譜檢測。以目標化合物質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2 GC-MS條件

1.2.2.1 GC條件

HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣，流速0.95 mL/min；進樣口溫度320℃，進樣量1 μL，不分流進樣；柱升溫程序為初始溫度180℃，保持1 min，以4℃/min升到300℃，保持25 min；溶劑延遲時間20 min。

1.2.2.2 MS條件

電子轟擊離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度300℃，離子源溫度250℃，質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～650。每種目標化合物定性、定量離子見表1。

表1 目標化合物定性、定量離子

1.2.3 中性氧化鋁柱的制備

參照GB/T 25223—2010《動植物油脂 甾醇組成和甾醇總量的測定 氣相色譜法》并稍作改進。在20 mL乙醇中加入10 g中性氧化鋁混合，并將混合液倒入層析柱中，使氧化鋁沉降并敲打至無縫隙，使用前打開活塞使乙醇液面到達氧化鋁頂層時關閉，備用。

1.2.4 樣品中三萜類化合物的提取及含量測定

準確稱取每批次油茶籽油樣品(0.50±0.01)g，3個重復，加入100 μL內(nèi)標物(1 mg/mL膽甾烷醇)和2%的氫氧化鉀-乙醇溶液，混勻，75℃下水浴回流1 h后冷卻至室溫，取5 mL皂化液至中性氧化鋁柱，先用5 mL乙醇洗滌不皂化物，后用30 mL正己烷洗脫并控制流速，收集洗脫液。洗脫液在65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干后復溶于5 mL正己烷，轉(zhuǎn)移到15 mL玻璃離心小管中，氮吹后加入100 μL硅烷化試劑(99∶1 BSTFA-TMCS和等體積無水嘧啶)衍生試劑，室溫放置15 min，加入1 500 μL正己烷稀釋，過0.22 μm有機濾膜，進樣，按1.2.2條件進行GC-MS分析，峰面積帶入標準曲線方程中計算各三萜類化合物的含量。

2 結果與分析

2.1 GC-MS方法學考察

2.1.1 GC-MS分離

按照1.2.1配制不同質(zhì)量濃度混標溶液,采用1.2.2的GC-MS條件，對11種目標化合物混標溶液進行GC-MS分析，所得GC-MS譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，11種目標化合物在GC-MS條件下均能有效分離。

注：1.角鯊烯；2.膽甾烷醇；3.菜籽甾醇；4.菜油甾醇；5.豆甾醇；6.羊毛甾醇；7.β-谷甾醇；8.β-香樹脂醇；9.羽扇豆醇；10.環(huán)阿屯醇；11.熊果醇；12.樺木醇。

2.1.2 線性關系

11種目標化合物的線性方程、相關系數(shù)及線性范圍見表2。

表2 11種目標化合物的線性方程、相關系數(shù)及線性范圍

由表2可以看出，各化合物線性范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均在0.99以上。

2.2 分離純化方法及洗脫劑的優(yōu)化

在NY/T 3111—2017《植物油中甾醇含量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》和GB/T 25223—2010《動植物油脂 甾醇組成和甾醇總量的測定 氣相色譜法》兩種方法的基礎上進行了改進，對比了中性氧化鋁柱層析和水-二氯甲烷液液萃取兩種分離純化植物油不皂化物效果，發(fā)現(xiàn)利用中性氧化鋁柱層析分離純化不皂化物，氮吹后干擾物質(zhì)少，省時省力，并能有效減少有機試劑的使用，因此采用中性氧化鋁柱層析分離油脂中不皂化物。此外對乙醚和正己烷提取效果進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)正己烷相對于乙醚提取，各種目標化合物峰形較好，最終采用正己烷作為提取溶劑。

2.3 不同精煉工序油茶籽油三萜類化合物含量變化

2.3.1 角鯊烯

角鯊烯是一種開鏈三萜類化合物，具有調(diào)控人體膽固醇代謝[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]、抗輻射[10]等功能。油茶籽油精煉過程中角鯊烯含量變化如表3所示。

表3 油茶籽油精煉過程中角鯊烯含量變化

由表3可以看出，油茶籽毛油中角鯊烯含量最高，為133.26 mg/kg。隨著精煉的進行角鯊烯含量降低，在成品油中，角鯊烯含量已降至55.73 mg/kg。與毛油相比，在脫酸、脫色、脫臭過程中，油茶籽油中角鯊烯含量分別下降16.31%、23.25%、12.29%，其中脫色步驟對角鯊烯影響較大，脫臭后灌裝為成品油前會貯藏于成品油罐中數(shù)月，可能導致成品油中角鯊烯含量下降6.33%。油茶籽油精煉過程中角鯊烯總損失58.18%，與張智敏等[11]報道油茶籽油精煉至脫臭步驟角鯊烯損失60.55%結論一致。

2.3.2 甾醇

植物甾醇是含有環(huán)戊烷多氫菲為骨架的一類四環(huán)三萜類化合物，在化學結構上與動物甾醇較為相似。植物甾醇具有抗癌[12-14]、改善血脂異常及預防動脈粥樣硬化[15-17]、抗炎[18]、抗氧化[19]的功效。油茶籽油精煉過程中甾醇含量變化見表4。

表4 油茶籽油精煉過程中甾醇含量變化 mg/kg

由表4可以看出，油茶籽浸出毛油總甾醇含量為1 506.59 mg/kg，并在油茶籽油樣品中均未檢測出菜籽甾醇，相比較毛油，油茶籽脫酸油、脫色油、脫臭油和成品油總甾醇含量分別下降18.10%、17.16%、13.28%和1.78%，脫酸和脫色對于總甾醇含量影響較大，總甾醇含量經(jīng)過精煉下降50.33%。油茶籽油中環(huán)阿屯醇和β-谷甾醇含量較高，其中環(huán)阿屯醇受脫色和脫臭影響較大，相比較毛油這兩個精煉工序造成環(huán)阿屯醇下降36.47%，經(jīng)過精煉環(huán)阿屯醇總體損失47.00%；而β-谷甾醇受脫酸影響較大，脫酸步驟損失36.56%，經(jīng)過精煉β-谷甾醇總體損失64.08%。工廠脫色一般采用白土吸附等工藝，三萜類化合物會隨之損耗，而脫臭主要是真空高溫分離脫臭油，溫度、真空度和時間均會影響油脂中三萜類化合物的損耗，尤其在250℃高溫條件下三萜類化合物易揮發(fā)造成損耗。

2.3.3 其他三萜類化合物含量

油茶籽油精煉過程中β-香樹脂醇和羽扇豆醇含量變化見表5。

表5 油茶籽油精煉過程中β-香樹脂醇和羽扇豆醇含量變化 mg/kg

由表5可以看出，與毛油相比，在精煉過程中，油茶籽脫酸油、脫色油、脫臭油和成品油中β-香樹脂醇含量分別下降11.52%、7.49%、7.48%、8.45%，整個精煉過程β-香樹脂醇含量下降34.94%。而羽扇豆醇含量在精煉過程中略有升高，具體原因還需進一步探明。各精煉工序油茶籽油中均未檢出α-香樹脂醇的代謝產(chǎn)物熊果醇和羽扇豆醇的代謝產(chǎn)物樺木醇。

β-香樹脂醇和羽扇豆醇是植物中合成三萜皂苷的兩個重要的前體物質(zhì)，近年來已有報道分離鑒定油茶中三萜皂苷，目前已分離的油茶三萜皂苷均來自于從β-香樹脂醇代謝而來的齊墩果烷型三萜皂苷[20-23]。結合本文實驗結果，我們推測β-香樹脂醇是油茶中三萜皂苷的主要代謝通路。

3 結 論

本文采用GC-MS測定油茶籽油精煉過程中三萜類化合物含量的變化，結果發(fā)現(xiàn)油茶籽油中環(huán)阿屯醇和β-香樹脂醇含量較高，油茶籽油中大部分三萜類化合物隨著精煉的進行含量均降低，其中角鯊烯含量受脫色過程影響較大，β-谷甾醇、β-香樹脂醇含量受脫酸影響較大，環(huán)阿屯醇受脫色和脫臭影響較大。受制于已有標準品的限制，本文檢測到的三萜類化合物種類仍然有限，還需要后續(xù)進一步挖掘，此外如何通過改進精煉工藝在去雜降害的情況下盡量保留油茶籽油中微量有益化合物將是下一步油茶籽油產(chǎn)業(yè)的焦點。