楊通靜，王 沁

（貴州省農(nóng)作物品種資源研究所,貴州貴陽(yáng) 550006）

天麻是具有內(nèi)生菌根的蘭科植物。它的植物體沒(méi)有根與綠葉，種子萌發(fā)后，主要依靠分解侵入其體內(nèi)的蜜環(huán)菌菌絲生活[1]。因此，天麻的有絲分裂標(biāo)本制作不能像其他植物那樣選用根、葉等組織結(jié)構(gòu)制備[2-4]。1984年梁漢興[5]以花粉小孢子觀察了原天麻染色體單倍體數(shù)目。2010年王德信[6]也以花粉小孢子為材料，觀察減數(shù)分裂過(guò)程中的細(xì)胞學(xué)特征。鑒定出天麻單倍體的染色體數(shù)目為18，但天麻染色體特征不能較好的呈現(xiàn)，也無(wú)法鑒定天麻的染色體倍數(shù)。為了有效觀察天麻染色體特征和鑒定其倍性，筆者擬從天麻不同組織、不同時(shí)間取樣制片，篩選出最佳取材部位，用于觀察天麻染色體有絲分裂中期的結(jié)構(gòu)特征。

1 材料與方法

1.1 材料

品種：純化4代以上的紅稈天麻。培育地點(diǎn)：天麻種質(zhì)資源圃。種質(zhì)來(lái)源：貴州省農(nóng)作物品種資源研究所真菌室課題組。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)方法

（1）天麻花柱頭培養(yǎng)

將成熟天麻（鸚哥嘴完整無(wú)損傷）塊莖埋于濕度在40%左右沙土中，置于22-25oC，相對(duì)濕度60%的環(huán)境下，讓其抽薹。

（2）花粉帽培養(yǎng)

將成熟天麻（鸚哥嘴完整無(wú)損傷）塊莖埋于濕度在40%左右沙土中，置于22-25oC，相對(duì)濕度60%的環(huán)境下，讓其抽薹。

（3）原球莖培養(yǎng)

將剛采摘（每年的5-7月）的成熟的天麻種子與萌發(fā)菌進(jìn)行拌種，置于培養(yǎng)好的固定菌床中覆土培養(yǎng)，自然條件下萌發(fā)，取不同大小的原球莖在不同時(shí)間段進(jìn)行觀察比較。

（4）初生莖

成熟天麻塊莖的鸚哥嘴人為掰斷后，將其塊莖埋于濕度在40%左右沙土中，自然條件下生長(zhǎng)，在不同時(shí)間取不同塊莖大小制片觀察。

1.2.2 標(biāo)本制備方法

制片基本流程：取材——預(yù)處理——固定——解離——清洗——染色——壓片——鏡檢。

1.3 制片

取材：1）柱頭：分別在不同開花期和同一天不同時(shí)間段取柱頭；2）花粉帽：分別在不同開花期和同一天不同時(shí)間段取材；3）原球莖：分別在不同發(fā)育期和不同時(shí)間段取原球莖；4）初生塊莖：分別在不同發(fā)育期和不同時(shí)間段取初生塊莖。

預(yù)處理：將材料置于0.002%-0.004%/L 8-羥基喹啉中，室溫處理50min左右，取出用蒸餾水漂洗2-3次。

固定：然后用新配的卡諾固定液進(jìn)行固定，時(shí)間為1h。

酸解：將清洗好的材料取下柱頭，因?yàn)樘炻榛ǖ闹^異于其他花，取時(shí)輕用鑷子進(jìn)行提取，置于1M鹽酸中60oC條件下酸解5min。

清洗：吸去酸解液，用蒸餾水輕輕洗2-3次。

染色：將固定后的材料（組培材料取莖尖0.2cm）置于干凈載玻片上，加改良后的卡寶品紅染液1-2滴，染色50min。

制片：用45%的冰醋酸洗1-2次，取干凈的蓋玻片蓋在材料上，先用鉛筆頭或者鑷子輕輕敲打，再用拇指壓片。

鏡檢：制備好后的標(biāo)本在顯微鏡下觀察，對(duì)有絲分裂相好的細(xì)胞進(jìn)行觀察、拍照。

1.3.1 分裂中期細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

分別在10×10倍和10×100倍顯微鏡下觀察、統(tǒng)計(jì)單張標(biāo)本中處于有絲分裂中期細(xì)胞總數(shù)。每個(gè)組織同時(shí)制備3份染色體標(biāo)本進(jìn)行鏡檢，計(jì)算平均數(shù)。

1.3.2 制備染色體有絲分裂標(biāo)本的組織及時(shí)間段優(yōu)劣比較

通過(guò)比較不同時(shí)間段、不同組織制備的標(biāo)本中處于染色體有絲分裂中期的細(xì)胞數(shù)量越多，說(shuō)明越利于制片觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織部位制備天麻有絲分裂標(biāo)本觀察對(duì)比結(jié)果

表1、表2及圖1、2的結(jié)果表明，天麻花粉帽在自然情況下，開花前5天花粉帽分裂處于高峰期，每天的 9：00-11：00處于有絲分裂中、后期的細(xì)胞較多，但是，總體數(shù)量相對(duì)較少。天麻花柱頭在自然情況下，開花前5天的上午9：00-11：00處于中期分裂相的細(xì)胞較多，單張制片中處于有絲分裂中期細(xì)胞數(shù)相對(duì)較多。

表3、表4 及圖3、4 的結(jié)果表明，自然狀態(tài)下，原球莖、天麻初生莖的細(xì)胞活躍期較為集中在10：00-12：00期間，此時(shí)，處于染色體有絲分裂中期的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多，但是，在下午13：00-14：00間，也能觀察到處于有絲分裂中期的細(xì)胞存在，但是相對(duì)較少。

表2 不同開花期柱頭及不同時(shí)間處于染色體分裂中期細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)表

表3 原球莖不同時(shí)期不同時(shí)間處于染色體分裂中期細(xì)胞數(shù)多少比較表

表4 天麻初生莖不同時(shí)期不同時(shí)間處于染色體分裂中期細(xì)胞數(shù)多少比較

圖1 不同開花期花粉帽在不同時(shí)間段處于染色體分裂中期細(xì)胞數(shù)分布圖

圖2 不同開花期柱頭及不同時(shí)間處于染色體分裂中期細(xì)胞數(shù)分布圖

圖3 原球莖不同時(shí)期不同時(shí)間處于染色體分裂中期細(xì)胞數(shù)分布圖

圖4 天麻初生莖不同時(shí)期不同時(shí)間處于染色體分裂中期細(xì)胞數(shù)多少比較

2.2 天麻不同組織部位制備的標(biāo)本難以程度結(jié)果

表5結(jié)果表明，四種組織中，花粉帽、原球莖和初生莖細(xì)胞壁難以解離，細(xì)胞不易分散，壓片難度大。柱頭制片各環(huán)節(jié)都較為容易，鏡檢結(jié)果較好。

表5 天麻不同取材部位制片難易程度比較

3 結(jié)論與分析

1）用天麻柱頭制備染色體有絲分裂標(biāo)本最佳。天麻初生塊莖和次生塊莖中活躍的細(xì)胞數(shù)量大大增加。但是，制片難度大，可能與細(xì)胞壁纖維化程度大有關(guān)系，且細(xì)胞活躍期分布不是太明顯可能是與由于土壤溫度回升較慢所致。

2）天麻開花當(dāng)天至開花前5天，上午9：00-11：00，柱頭細(xì)胞分裂處于活躍期，且柱頭組織比較軟，有利于染色體標(biāo)本的制備。天麻開花后隨著時(shí)間的推移，其柱頭表面黏性逐漸減弱，組織結(jié)構(gòu)逐漸變硬，導(dǎo)致制備染色體有絲分裂中期標(biāo)本過(guò)程中解離難度增加，開花3天后的柱頭很難獲得分散較好的細(xì)胞標(biāo)本。這可能是柱頭暴露在空氣中后，水分揮發(fā)導(dǎo)致其組織結(jié)構(gòu)收縮變硬，同時(shí)制片過(guò)程中沒(méi)有促使細(xì)胞膜擴(kuò)張?zhí)幚硭隆?/p>

3）花粉帽、原球莖、初生莖雖然在不同的時(shí)間段有少數(shù)細(xì)胞可以觀察到處于有絲分裂中期的細(xì)胞，這可能與細(xì)胞活躍程度直接相關(guān)。且解離難度較大，背景色腳深，很難找到較為理想的染色體有絲分裂中期圖片，細(xì)胞壁纖維化程度增加以及細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)增加相關(guān)。