趙曉萌，買雨晨，喬自林,2,3 ，楊 琨,2*

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730100;2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030;3.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

牦牛是我國以青藏高原為起源的高原特種動物，能在海拔3 000～4 000 m左右、氧分壓在11 600～14 500 Pa的高寒氣候中正常生存，其生長發(fā)育、新陳代謝等各方面的生理機能與當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境形成了良好的適應(yīng)機制，是研究高原生物低氧適應(yīng)性的良好材料。

異源二聚體缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1）由氧不穩(wěn)定的α亞基和氧穩(wěn)定的β亞基組成[1]，是維持體內(nèi)氧環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)節(jié)氧需求與供應(yīng)的重要因子。缺氧誘導(dǎo)因子-1α作為能決定缺氧誘導(dǎo)因子-1活性的唯一氧調(diào)節(jié)亞單位[2]，要想發(fā)揮其功能必須要保持其穩(wěn)定性, HIF-1α蛋白的穩(wěn)定性是由氧依賴性和非氧機制調(diào)節(jié)的[3]。在正常氧氣濃度下，HIF-1α經(jīng)泛素化迅速降解[4]后表達(dá)很少。在低溫缺氧條件下，HIF-1α與HIF-1β形成二聚體入核后結(jié)合HRE，使缺氧表達(dá)下顯著增高[5]。此外，HIF-1α還能夠介導(dǎo)能量代謝、細(xì)胞的生長和凋亡、血管新生、氧的攝取和運輸?shù)缺磉_(dá)，參與細(xì)胞內(nèi)氧平衡狀態(tài)的調(diào)節(jié)[6]。

本研究以牦牛肺臟作為實驗樣本，應(yīng)用石蠟切片、HE染色和免疫組化的方法來探索HIF-1α在牦牛肺部的表達(dá)及分布情況以及HIF-1α對高原動物低溫缺氧的作用，具有高度的創(chuàng)新性和研究價值，旨在進(jìn)一步為HIF-1α對高原動物低氧性的機制提供理論依。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 甘肅省臨夏回族自治州某屠宰場采集牦牛健康肺臟。經(jīng)宰割后迅速將牦牛肺臟樣本放于4%的多聚甲醛中固定。

1.1.2 試劑與儀器 0.01mol/LPBS磷酸鹽緩沖液，0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液，兔多克隆抗體HIF-1α（bs-1313R）、免疫組化試劑盒（SP-0023），DAB顯色試劑盒（DA1015-3)，均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，病理組織切片機、顯微鏡照相系統(tǒng)等。

1.2 HE染色及免疫組化SP染色

1.2.1 蘇木精-伊紅染色 牦牛肺臟樣本經(jīng)梯度乙醇脫水、常規(guī)石蠟包埋后，切成石蠟切片（厚4 μm），隨后進(jìn)行脫蠟，染色，脫水透明，封片，其具體的HE染色方法按說明書來進(jìn)行。

1.2.2 免疫組化SP染色 HIF-1α兔多克隆抗體濃度稀釋1:100，按抗體說明書4℃冰箱凍藏，用前及時解凍。石蠟切片脫蠟復(fù)水后，用PBS浸泡5 min后進(jìn)行經(jīng)抗原修復(fù)、阻斷劑阻斷、封閉液封閉，滴加一抗孵育，陰性對照組不加入兔多克隆抗體HIF-1α。滴加DAB顯色液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。光鏡下觀察顯色，適宜可終止反應(yīng)。自來水沖洗10 min后按HE染色步驟進(jìn)行蘇木精復(fù)染至封片鏡檢。

1.3 圖像采集及結(jié)果判定

將染色完成的切片放置于顯微鏡照相系統(tǒng)下采集信息圖像。免疫組織化學(xué)染色后在顯微鏡下根據(jù)著色程度可呈現(xiàn)出強陽性、中性陽性、弱陽性和陰性表達(dá)四種結(jié)果。若HIF-1α在胞漿、胞核呈現(xiàn)深棕黃色或黃褐色則為強陽性表達(dá)、棕黃色較淺是弱陽性表達(dá)、處于二者之間是中性陽性表達(dá)、未出現(xiàn)棕黃色或與背景色相似的是陰性表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛肺臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)

牦牛肺臟內(nèi)支氣管分支、大量肺泡及肺泡間隔組織。終末細(xì)支氣管環(huán)行平滑肌較為明顯且完整，肺泡多為半球型小囊，或圍成肺泡管、肺泡囊，可見肺泡上皮細(xì)胞。由I型上皮細(xì)胞包覆的肺泡壁較?。ㄒ妶D1）。

圖1 牦牛肺臟組織切片HE染色結(jié)果

2.2 免疫組織化學(xué)中的表達(dá)

HIF-1α在牦牛肺臟組織呈廣泛性表達(dá)。依據(jù)免疫組化結(jié)果展示HIF-1α在細(xì)胞表達(dá)陽性顏色的深淺可知，肺泡、終末細(xì)支氣管環(huán)形平滑肌呈現(xiàn)棕黃色，為強陽性表達(dá)。肺泡隔間充質(zhì)細(xì)胞質(zhì)呈中性表達(dá)且少量表達(dá)。細(xì)胞核內(nèi)呈陰性表達(dá)（見圖2）。

圖2 牦牛肺臟HIF-1α蛋白免組織化學(xué)檢測結(jié)果

3 討論

肺臟是機體在高原環(huán)境下最先進(jìn)行代償?shù)钠鞴伲彩莿游餀C體與外界進(jìn)行氣體交換的場所。長期生活在低氧環(huán)境的牦牛的肺氣-血屏障較薄，能在氣體交換過程中更有利于單位時間內(nèi)的氧氣交換量[7]。對于肺臟不同結(jié)構(gòu)HIF-1α表達(dá)的功能也不同。在肺臟中毛細(xì)血管對HIF-1α存在依賴，且肺泡-毛細(xì)血管屏障功能對肺臟起著重要調(diào)控作用，當(dāng)其功能發(fā)生紊亂時會導(dǎo)致嚴(yán)重的肺水腫、肺損傷等情況[8]；在肺泡肺氣管發(fā)育中能調(diào)控血管網(wǎng)絡(luò)的形成，當(dāng)肺血管發(fā)育不足時會造成肺泡的形成不良[9]；在生長因子的內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1a能調(diào)控其表達(dá)，通過增強血管的通透性促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖[10、11]，以此來誘導(dǎo)血管生成因子的生成與表達(dá)，維持血管的平衡。

HIF-1α作為低氧調(diào)控的關(guān)鍵介質(zhì)，在常氧下幾乎不發(fā)生表達(dá)，在缺氧時呈高度表達(dá)。HIF-1α不僅能促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，還能介導(dǎo)炎癥的形成產(chǎn)生。在低溫缺氧條件下，HIF-1α能夠激活血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)等來促進(jìn)肺血管的重構(gòu)，從而使組織細(xì)胞保持耐受低氧穩(wěn)定狀態(tài)[12]，參與細(xì)胞代謝、血管收縮、炎癥、氧的攝取等多種生理病理過程,在各種細(xì)胞組織中發(fā)揮作用。但也會通過激活不同的炎癥因子引起肺急性肺損傷、肺癌、慢性阻塞性肺炎等病癥。當(dāng)肺小動脈肌化作用加強, 誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞和肺動脈外膜成纖維細(xì)胞增殖造成肺血管重構(gòu)時,則會引發(fā)肺動脈高壓[13]。但也有研究表明HIF-1α的部分缺失會使肺動脈高壓癥狀減輕，以此說明對HIF-1α慢性缺氧引起的病理變化具有保護(hù)作用[14]。

有學(xué)者已經(jīng)得出HIF-1α在牦牛的心臟中表達(dá)程度最高，其次是肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織[15]的結(jié)論，證明HIF-1α在肝臟存在表達(dá)。本研究則得出HIF-1α在牦牛肺臟中的肺泡管、終末細(xì)支氣管環(huán)形平滑肌中呈現(xiàn)高度表達(dá)的情況，HIF-1α大量分布于肺的導(dǎo)氣部，表明低溫缺氧能刺激HIF-1α在肺導(dǎo)氣部的表達(dá)，從而對牦牛的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。

4 結(jié)語

本研究顯示缺氧誘導(dǎo)因子-1α在牦牛肺臟中的肺泡管、終末細(xì)支氣管環(huán)形平滑肌中呈強陽性，肺泡隔間充質(zhì)細(xì)胞質(zhì)呈中性表達(dá)且少量表達(dá)，在細(xì)胞核內(nèi)呈陰性表達(dá)。以此得出低溫缺氧的條件下牦牛肺臟能夠表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子-1α的特性，進(jìn)而推測缺氧誘導(dǎo)因子-1α對高原動物低溫缺氧適應(yīng)性起著重要調(diào)節(jié)作用。