楊行健，胡 懿，顧 妍，蔣卓衡，何祝清

（1. 華東師范大學(xué) 第二附屬中學(xué)（張江校區(qū)），上海 201203；2.生物學(xué)青少年實踐工作站，生命科學(xué)學(xué)院，華東師范大學(xué)，上海 200241；3.華東師范大學(xué)第二附屬中學(xué)（紫竹校區(qū)），上海 200241；4.蘇州工業(yè)園區(qū)星海實驗中學(xué)，江蘇 蘇州 215100；5.南京紫金山昆蟲博物館，江蘇 南京 210000；6.生物博物館，生命科學(xué)學(xué)院，華東師范大學(xué)，上海 200241；7.長江三角洲河口濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部和上海市野外科學(xué)觀測研究站，華東師范大學(xué)，上海 200241）

天蛾科Sphingidae 隸屬于鱗翅目Lepidoptera 蠶蛾總科Bombycoidea，全世界包括200 多個屬，1 400 余種，遍布除南極洲外的各個大陸[1]。天蛾（天蛾科昆蟲的統(tǒng)稱）是重要的農(nóng)業(yè)昆蟲，成蟲在傳粉上有重要作用，但是幼蟲又大量取食各種農(nóng)作物。由于其個體大、便于采集、種類多，是用于研究形態(tài)功能學(xué)[2]、協(xié)同進(jìn)化[3-4]、生物地理學(xué)[5]等的良好材料。

然而，這些研究都需要建立在可信的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究基礎(chǔ)之上。早期的系統(tǒng)發(fā)育研究主要體現(xiàn)在高級階元（亞科、族）的劃分。Rothschild 等最先為天蛾科物種作科學(xué)化的分類，分為感毛組與無感毛組兩大組，下設(shè)五亞科七族[6]。朱弘復(fù)和王林瑤編寫的《中國動物志昆蟲綱第11 卷鱗翅目天蛾科》（以下簡稱動物志）中[7]，其分類系統(tǒng)的參考即是該體系，之后國內(nèi)多數(shù)有關(guān)天蛾的研究也多沿襲《動物志》中五亞科分類系統(tǒng)[8-14]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，采用分子標(biāo)記重建系統(tǒng)發(fā)育樹的研究隨之展開。然而，這些研究或者個體較少，或者僅研究某屬或某族，缺乏整體性的把握[15-17]。直到2009 年，Kawahara 等通過測序131 種天蛾的5 個編碼核基因（6 793bp），重建了全球范圍內(nèi)的天蛾系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，確立了三亞科分類體系，其下共設(shè)八族[1]。

本研究基于中國浙江北部及上海市的天蛾標(biāo)本，以COI基因為分子標(biāo)記，重建了系統(tǒng)發(fā)育樹，比較了Kawahara 和朱弘復(fù)等提出的2 種分類系統(tǒng)的異同。

1 材料和方法

1.1 研究材料

試驗樣品于2016 年和2019 年6-8 月采集自浙江北部的桐廬天子地生態(tài)風(fēng)景旅游區(qū)、天童山國家森林公園、清涼峰國家級自然保護(hù)區(qū)及上海的金山區(qū)增豐村、崇明區(qū)陳家鎮(zhèn)、閔行區(qū)華東師范大學(xué)校區(qū)。采集方法包括燈誘法、網(wǎng)捕法和飼養(yǎng)法。其中，盾天蛾指名亞種Phyllosphingia dissimilis dissimilis樣品2，3，6 為土中挖掘得到的蛹，后羽化成蟲，福瑞茲長喙天蛾Macroglossum fritzei樣品2，3為掃網(wǎng)所得，其余樣品均為夜晚燈誘采集。其中，在桐廬樣點設(shè)置了4 個誘燈，每3 h 采集一次。采集到的天蛾采用75%醫(yī)用酒精注射腹部致死，取2～ 3 條后足保存于無水乙醇中，并將后足及標(biāo)本對應(yīng)編號。將取足后的天蛾置于三角包中室溫通風(fēng)保存，用于制作干制標(biāo)本及形態(tài)鑒定。本次研究共采集到天蛾樣品94 只，共計31 種；另有2 種蠶蛾（柞蠶Antherea pernyi及華尾大蠶蛾Actias sinensis）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外群，見表1。

圖1 采集的天蛾部分種類標(biāo)本Figure 1 Some collected Sphingidae

1.2 DNA 提取及COI 基因擴(kuò)增

采用AxyPrep Genomic DNA Miniprep Kit (AXYGEN)試劑盒對各樣品DNA 進(jìn)行提取。COI基因擴(kuò)增PCR采用Taq PCR Master Mix 酶，引物采用LCO1490（5’-GGT CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’）和HCO2198（5’-TTA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’），由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成，PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 2 min，變性94℃ 30 s，退火45℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，終延伸72℃ 7 min，循環(huán)30 次。PCR 產(chǎn)物送交鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行雙向測序。各樣品GenBank 號詳見表1。

表1 樣品采集信息及GenBank 號Table 1 Samples collected and GenBank number

表1續(xù)

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

對測序結(jié)果，首先采用Bioedit 軟件對COI基因的峰圖進(jìn)行篩選，對有雙峰或底峰的序列需要重新進(jìn)行PCR的擴(kuò)增及測序，查找問題。而結(jié)果準(zhǔn)確的雙向測序序列則利用ATGC7 軟件進(jìn)行拼接，并將拼接后的序列導(dǎo)入MEGA7 軟件進(jìn)行ClustalW 比對，去掉左右的引物序列，得到658bp 的基因序列，將其以FASTA 文件格式保存并輸出。本研究選用最大似然法（Maxiumum likelihood，ML）對COI基因片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，基于GTR 模型進(jìn)行1 000 次分析（Bootstrap value），最終構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

研究測得了全部96 個樣品的COI基因片段（658bp），將其重建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2。由圖1 可知，天蛾科是個單系群，同種同屬全部各自聚在一起，后驗概率全部 > 95%（平背天蛾除外，采集自桐廬的4 個平背天蛾個體各自聚為2 小支）。天蛾科首先分為2 大支A 和B。A 支包括六點天蛾屬Marumba，鬼臉天蛾屬Acherontia，大背天蛾屬Meganoton，白薯天蛾屬Agrius，霜天蛾屬Psilogramma，鋸翅天蛾屬Langia，星天蛾屬Dolbina，鷹翅天蛾屬Ambulyx，豆天蛾屬Clanis，構(gòu)月天蛾屬Parum，錘天蛾屬Neogurelca，盾天蛾屬Phyllosphingia，其中大背天蛾屬，白薯天蛾屬，霜天蛾屬親緣關(guān)系較近，其余相互關(guān)系不明確。B 支分為2 小支，一支包括長喙天蛾屬Macroglossum，缺角天蛾屬Acosmeryx；另一支包括葡萄天蛾屬Ampelophaga，灰天蛾屬Acosmerycoides，背線天蛾屬Cechetra，斜紋天蛾屬Theretra，白肩天蛾屬Rhagastis，紅天蛾屬Deilephila。。

圖2 基于COI 基因（658bp）的浙江北部及上海天蛾科昆蟲系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系圖Figure 2 Phylogenetic relationship of Sphingidae from northern Zhejiang and Shanghai based on COI genes (658bp)

3 結(jié)論與討論

3.1 COI 用于物種鑒定的有效性

Hebert 等在2003 年首次提出了DNA 條形碼的概念[18]。雖然DNA 條形碼的研究仍存在一定的爭議，但其在動物分類學(xué)中的研究已相對成熟，并將COI基因選取作為動物界標(biāo)準(zhǔn)鑒定基因。COI基因位于線粒體內(nèi)，參與線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶(Cytochrome C oxidase)第一亞基的編碼，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子。該基因理論上分布于一切有氧呼吸的真核生物體內(nèi)，其遺傳模式呈典型的母系遺傳[19]。相對于12S 和16S 等mt-rDNA，COI基因具有較少的插入和缺失現(xiàn)象，分子進(jìn)化形式以點突變?yōu)橹鳎欣谔岣咝蛄斜葘Y(jié)果的可靠性，對于區(qū)分屬以下的分類單元而言具有足夠的分辨能力。該技術(shù)在發(fā)現(xiàn)和描述新種或隱種、種類分子鑒定、系統(tǒng)發(fā)育等研究中廣泛應(yīng)用[20]。在同種之間，COI基因序列幾乎一致，而不同種之間隨著親緣關(guān)系的疏遠(yuǎn)而變異加大。徐淼鋒等通過測序進(jìn)口水果中的幼蟲COI基因，發(fā)現(xiàn)其為蘋果異脛小卷蛾Cryptophlebia leucotreta[21]。陳秀潔等通過COI基因能夠很好地區(qū)分四種粘蟲Mythimna separata的近緣種[22]。和淑琪等利用COI基因?qū)τ谛挛魈m蘋淺褐卷蛾Epiphyas postvittana研究發(fā)現(xiàn)，同種間序列差異小于3%[23]。陳珊等研究發(fā)現(xiàn)巨癤蝙蛾P(guān)hassus giganodus 的卵、幼蟲、成蟲的COI基因具有高度一致性[24]。本研究共計測序了32 種天蛾的94 個個體，同一物種間的COI基因幾乎一致，如大背天蛾指名亞種采集自浙江桐廬、天童山及清涼峰三個地區(qū)，但其序列差異小于1%，進(jìn)一步證實了COI基因用于鑒定動物物種的可靠性。

3.2 通過COI 基因探討系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

由于COI基因快速突變的特點，不少研究將其用于生物地理學(xué)或系統(tǒng)發(fā)育等相關(guān)研究。如李玉婷等基于COI基因研究發(fā)現(xiàn)，其能夠較好地對蘋果蠹蛾Cydia pomonella的種群分化進(jìn)行標(biāo)記[25]。而盧慧通過COI基因?qū)χ袊润芓rigonidiidae 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，屬種水平上支持率較高，而高階上的支持率較低[26]。同樣，基于COI基因在對鱗翅目Lepidoptera、雙翅目Diptera、直翅目Orthoptera 等構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹也發(fā)現(xiàn)，同種及同屬間具有較高的支持度，而族、亞科等相互間的系統(tǒng)關(guān)系得不到很好的解析[27-30]。

對于天蛾科昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育研究主要體現(xiàn)在高級分類階元的劃分。在《動物志》中，中國天蛾科被劃分為5 亞科（面形天蛾亞科Acherontiinae、云紋天蛾亞科Ambulicinae、透翅天蛾亞科Sesiinae、蜂形天蛾亞科Philampelinae 和斜紋天蛾亞科Choerocampinae），而由Kawahara 等認(rèn)為天蛾科分為長喙天蛾亞科Macroglossinae、目天蛾亞科Smerinthinae、天蛾亞科Sphinginae，蔣卓衡在對于中國長喙天蛾屬及斜紋天蛾屬研究中也參照此系統(tǒng)[31]。兩種分類系統(tǒng)之間，長喙天蛾亞科=蜂形天蛾亞科+斜紋天蛾亞科+透翅天蛾亞科，而Kawahara 的目天蛾亞科、天蛾亞科與《動物志》的蜂形天蛾亞科和斜紋天蛾亞科既有重疊的部分，又有相互矛盾的部分。

本研究首次采用COI基因，對中國浙江北部地區(qū)及上海市的天蛾科系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究。在A 支中，兩種分類系統(tǒng)的分歧點是星天蛾屬的親緣關(guān)系問題。本研究結(jié)果顯示星天蛾屬更接近鋸翅天蛾屬、霜天蛾屬、白薯天蛾屬和大背天蛾屬，這與《動物志》中將這些歸為面形天蛾亞科更吻合。除上述5 屬外，其余屬無論在Kawahara的目天蛾亞科還是《動物志》的云紋天蛾亞科均為并系類群。最后，喜馬錘天蛾無論在上述2 個分類系統(tǒng)中均屬于B 支，但本研究結(jié)果支持其在A 支中。在B 支中，Kawahara 等將其全部歸為長喙天蛾亞科，而《動物志》將其分為斜紋天蛾亞科和蜂形天蛾亞科（本研究未涉及透翅天蛾亞科）。根據(jù)葡萄天蛾屬和灰天蛾屬的系統(tǒng)關(guān)系，《動物志》所提出的二亞科非單系群。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)COI基因能夠很好地鑒定不同種類的天蛾，且不同產(chǎn)地的同一物種具有極高的序列相似性；系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明天蛾分為2 大支，其分類結(jié)果各支持上述兩種分類系統(tǒng)的部分結(jié)果，但在A 支中屬與屬之間的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的后驗概率均不高，不能很好地明晰各屬間相互關(guān)系，在今后的研究中應(yīng)采用多基因建樹，或者系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)對天蛾科的演化關(guān)系進(jìn)行更為深入的研究。