李良玉 劉晚霞 李朝陽 牛廣財(cái)*

（1 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國家雜糧工程技術(shù)研究中心 黑龍江大慶163319 2 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 哈爾濱150040 3 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院 黑龍江大慶163319）

抗性糊精是由淀粉加工而成的一種新型的水溶性膳食纖維，具有低黏度，低熱量，難消化，穩(wěn)定性良好等特性[1-3]，具有降低血糖，整理腸道，調(diào)節(jié)血脂，促進(jìn)消化道益生菌生長繁殖等作用[4-7]，在食品加工中具有廣闊的發(fā)展前景。很多專家學(xué)者、科研人員投身于抗性糊精的制備與純化研究中[8-14]，然而由于各種原因均難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用國際上先進(jìn)的模擬移動(dòng)色譜技術(shù)純化抗性糊精，旨在探索模擬移動(dòng)色譜高效純化抗性糊精的方法，為抗性糊精的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。此外，由于不同淀粉的單糖組成、含量及連接方式不同，制備得到的抗性糊精的分子特性也不盡相同，以綠豆淀粉為原料，對純化后的綠豆抗性糊精進(jìn)行分子特性分析，為抗性糊精的分子合成機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系機(jī)制等研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆淀粉原料，煙臺雙塔食品有限公司；強(qiáng)酸性陽離子凝膠型色譜樹脂CSR-3K+，淄博東大化工股份有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma-Aldrich公司。

6890N/MSD5973 GC-MS 分析儀，美國Agilent 公司；高效尺寸排阻色譜-十八角激光光散射儀-示差折光檢測器聯(lián)用系統(tǒng)，美國Wyatt 公司；尺寸排阻色譜柱 （TSK G5000 PW 7.5 mm × 600 mm），日本TOSOH 公司；RPL-ZD10 液相色譜分析型裝柱機(jī)，大連日普利科技儀器有限公司；制備色譜系統(tǒng)、順序式模擬移動(dòng)色譜分離實(shí)驗(yàn)設(shè)備（SSMB-6Z6L 型），國家雜糧工程技術(shù)研究中心制造；1200s 液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠豆抗性糊精制備方法 工藝流程：綠豆淀粉→烘干→酸處理→熱解→冷卻溶解→液化→糖化→脫色→脫鹽→濃縮。

稱取一定量的淀粉烘干至含水量5%以下，噴霧加1%的鹽酸，加酸量為體積分?jǐn)?shù)7%，于干燥箱中90 ℃預(yù)干燥1 h，然后在160 ℃下熱解2 h，熱解結(jié)束后取出自然冷卻。將熱解產(chǎn)物加3 倍體積的水制成30%溶液，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH值為6.0，加入耐高溫α-淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%在95 ℃反應(yīng)2 h，然后調(diào)pH 值至4.5，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%糖化酶糖化2 h，反應(yīng)結(jié)束后滅酶，過濾。采用活性炭脫色，陰陽離子色譜脫鹽，真空濃縮，得到綠豆抗性糊精制備液[15]。

1.2.2 樹脂預(yù)處理與裝填方法 稱取200 mL CSR-3K+樹脂用去離子水反復(fù)沖洗，去除破損樹脂及加工過程中的雜質(zhì)，用去離子水浸泡過夜，采用液相色譜裝柱機(jī)進(jìn)行樹脂裝填，裝填后用去離子持續(xù)沖洗，直至流出液的電導(dǎo)與去離子水一致，期間不斷升溫至60 ℃，樹脂裝填完成后備用。

1.2.3 制備色譜評價(jià)試驗(yàn) 在前期研究的基礎(chǔ)上，按照進(jìn)料折光率60%，進(jìn)料9 mL，柱溫60 ℃，洗脫流速1.6 mL/min 做制備色譜分離試驗(yàn)，采用手持糖度計(jì)測定濃度，液相色譜分析樣品純度，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果繪制綠豆抗性糊精的單柱洗脫曲線圖。

1.2.4 綠豆抗性糊精的SSMB 純化技術(shù)研究 試驗(yàn)采用SSMB-6Z6L 順序式模擬移動(dòng)色譜裝置進(jìn)行SSMB 純化抗性糊精的分離試驗(yàn)，工藝流程見圖1。系統(tǒng)共為6 根色譜柱，以串聯(lián)方式連接，一個(gè)運(yùn)行周期日每根色譜柱均要經(jīng)過全進(jìn)全出（S1）、大循環(huán)（S2）、小循環(huán)（S3）3 個(gè)步驟。當(dāng)系統(tǒng)運(yùn)行到某一根色譜柱時(shí)，第1 步：其上端進(jìn)解吸劑D，下端放出AD（雜糖組分），間隔第3 根柱的柱上端進(jìn)F（原料），在間隔的第4 根色譜柱柱下端放出BD（抗性糊精組分）；第2 步：物料在體系中不進(jìn)不出，只進(jìn)行大循環(huán)；第3 步：上端進(jìn)解吸劑D，在間隔的第4 根色譜柱下端放出BD（抗性糊精組分）。然后切換到下一根色譜柱，依次重復(fù)3個(gè)步驟，然后循環(huán)下去直至試驗(yàn)結(jié)束[16]。

圖1 SSMB 工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram of SSMB

1.2.5 電鏡測定方法 采用掃描電鏡分別對綠豆淀粉原料及純化后的綠豆抗性糊精進(jìn)行分析、觀察處理前、后樣品的形貌特征。

1.2.6 紅外光譜測定方法 將綠豆淀粉原料及純化后的綠豆抗性糊精分別與KBr 混合研磨，利用真空壓片機(jī)進(jìn)行壓片，在4 000～400 cm-1范圍進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.7 X 射線衍射測定方法 將綠豆淀粉原料及純化后的綠豆抗性糊精進(jìn)行干燥、粉碎，采用X 射線衍射儀測定。

1.2.8 分子質(zhì)量測定方法 參考肖健等[17]的方法，利用排阻色譜-十八角度激光光散射儀-示差折光檢測器聯(lián)機(jī)系統(tǒng)測定綠豆抗性糊精的分子質(zhì)量及分布情況。采用牛血清白蛋白對儀器進(jìn)行校正，流動(dòng)相為0.15 mol/L NaNO3和0.02%NaN3，流速0.4 mL/min，結(jié)果采用ASTRA 6.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.9 單糖組成分析方法 參考Ciucanu 等[18]的方法并稍作改動(dòng) （樣品處理全過程需要氮?dú)獗Ｗo(hù)），具體參考曹榮安等[19]的方法：首先進(jìn)行還原和乙酰化處理，然后利用GC-MS 分析，色譜柱為HP-5MS 石英毛細(xì)管色譜柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm），根據(jù)氣譜出峰時(shí)間和質(zhì)譜的離子峰對單糖進(jìn)行定性分析，確定綠豆抗性糊精的單糖組成。

1.2.10 其它測定方法 糖濃度、純度、收率、分離度的測定方法與文獻(xiàn)[16]中的方法一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備液分析結(jié)果

采用高效液相色譜對抗性糊精制備液原料液進(jìn)行分析，分析結(jié)果見圖2和表1。

2.2 制備色譜評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果

制備色譜評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果見表2，洗脫曲線圖見圖3。

從表2和圖3可以看出，抗性糊精和雜糖的保留時(shí)間相差較大，通過計(jì)算分離度達(dá)到0.53，雖然還有一些重合部分沒有完全分開，但可通過模擬移動(dòng)色譜加長分離距離和時(shí)間，增加洗脫進(jìn)水量，并通過試驗(yàn)優(yōu)化達(dá)到很好的分離效果。

2.3 綠豆抗性糊精的SSMB 純化工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)制備色譜評價(jià)試驗(yàn)結(jié)果，確定SSMB 的進(jìn)料折光60%，溫度60 ℃，通過SSMB 法純化抗性糊精的技術(shù)參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果見表3。

表1 抗性糊精原料分析結(jié)果Table 1 HPLC analysis of Phaseolus radiates L.resistant dextrin preparation liquid

圖2 綠豆抗性糊精原料分析圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of Phaseolus radiates L.resistant dextrin

圖3 洗脫曲線圖Fig.3 The chart of elution curve

表2 制備色譜試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The test results of preparation chromatographic

（續(xù)表2）

表3 SSMB 分離操作條件和試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Operation conditions and test results on SSMB

由表3可知，綜合考慮進(jìn)樣量、料水比、出口折光、純度和收率等指標(biāo)，第6 組試驗(yàn)的效果好于其它6 組，因此確定最佳分離條件為：進(jìn)料量455 g/h，進(jìn)水量682 g/h，循環(huán)量346 mL，此時(shí)出口折光為24.6%，純度達(dá)到99.17%，收率達(dá)到91.31%。經(jīng)SSMB 分離后抗性糊精組分的液相色譜圖，見圖4。

2.4 電鏡測定結(jié)果與分析

綠豆淀粉及綠豆抗性糊精的電鏡測定結(jié)果，見圖5。

從掃描電鏡圖可看出，在相同放大倍數(shù)下，綠豆淀粉與純化后的綠豆抗性糊精具有完全不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)。綠豆淀粉顆粒較小，顆粒差異不大，為規(guī)則的橢圓形顆粒，顆粒表面光滑，這與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[20-22]；而純化后綠豆抗性糊精的顆粒較大且顆粒大小不一，為不規(guī)則碎片，顆粒表面粗糙，無定型結(jié)構(gòu)。這是由于在酸和熱的作用下，淀粉分子被打碎后，無規(guī)律的重新組合，聚合度大小不一，導(dǎo)致純化后綠豆抗性糊精的顆粒大小不一，表面粗糙，更有利于水分子進(jìn)入，因此，綠豆抗性糊精較綠豆淀粉的溶解性更好，黏度較小。

圖4 抗性糊精組分液相色譜分析圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of Phaseolus radiates L.resistant dextrin component

表4 抗性糊精組分液相色譜分析結(jié)果Table 4 HPLC analysis of Phaseolus radiates L.resistant dextrin component

圖5 綠豆淀粉及綠豆抗性糊精的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of Phaseolus radiates L.starch and Phaseolus radiates L.resistant dextrin

2.5 紅外光譜測定結(jié)果與分析

綠豆淀粉及綠豆抗性糊精的紅外光譜測定結(jié)果，見圖6。

圖6 綠豆淀粉及綠豆抗性糊精的紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectrum of Phaseolus radiates L.starch and Phaseolus radiates L.resistant dextrin

綠豆淀粉與綠豆抗性糊精在2 900，2 300，2 000，1 600 cm-1附近均有吸收峰，且兩者紅外光譜特征峰的峰形、位置沒有明顯變化，只是部分吸收峰的大小存在差異，這與相應(yīng)化學(xué)鍵的含量有關(guān)，說明綠豆淀粉與綠豆抗性糊精的化學(xué)鍵或官能團(tuán)沒有發(fā)生明顯變化。

2.6 X 射線衍射測定結(jié)果與分析

綠豆淀粉及綠豆抗性糊精的X 射線衍射測定結(jié)果，見圖7。

由圖7可以看出，綠豆淀粉的結(jié)晶類型為C型結(jié)晶，2θ 分別為15.36°，17.32°，23.38°，經(jīng)擬合分析其結(jié)晶度為34.37%，與現(xiàn)有研究一致[23-24]。綠豆抗性糊精的衍射峰很寬，直觀看結(jié)晶度不高，其2θ 在20°左右，屬于典型的非晶譜，因此綠豆抗性糊精屬于非晶態(tài)。這是由于綠豆淀粉在酸熱條件下降解，原有綠豆淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，而抗性糊精是以葡萄糖為主體的葡聚糖，為非晶態(tài)。

2.7 分子質(zhì)量測定結(jié)果與分析

綠豆淀粉及綠豆抗性糊精分子質(zhì)量測定結(jié)果，見圖8。

圖7 綠豆淀粉及綠豆抗性糊精的X 射線衍射譜圖Fig.7 XRD spectrum of Phaseolus radiates L.starch and Phaseolus radiates L.resistant dextrin

圖8 綠豆淀粉及綠豆抗性糊精的示差折光檢測曲線Fig.8 RI of Phaseolus radiates L.starch and Phaseolus radiates L.resistant dextrin

由圖8a和8b 可以看出，綠豆淀粉及綠豆抗性糊精的示差折光檢測曲線上均只有單一峰，說明兩者的分子質(zhì)量相對集中，利用ASTRA 6.1 軟件分析可知，綠豆淀粉和綠豆抗性糊精的分子質(zhì)量分別為（6 107.1±68.9）×103u 和（796.4±9.6）×103u，回轉(zhuǎn)半徑（Rg）為（280.4±10.4） nm 和（279.4±11.7）nm。綠豆抗性糊精的分子質(zhì)量大約在800 ku 左右，而目前市面上常見的低聚果糖、菊粉等水溶性膳食纖維的分子質(zhì)量只有幾千到幾萬道爾頓，可見，綠豆抗性糊精的分子質(zhì)量顯著高于這些水溶性膳食纖維，因此，綠豆抗性糊精應(yīng)具有一些獨(dú)特的生物活性，需進(jìn)一步研究。

2.8 抗性糊精單糖組成測定結(jié)果與分析

綠豆淀粉及綠豆抗性糊精單糖組成測定結(jié)果，見表5。

表5 綠豆淀粉及綠豆抗性糊精的單糖組成（%）Table 5 Monosaccharide compositions of Phaseolus radiates L.starch and Phaseolus radiates L.resistant dextrin（%）

由表5可以看出，綠豆淀粉的單糖組成相對于綠豆抗性糊精較為多樣，共含有6 種單糖，而抗性糊精中的單糖組成只有3 種，以葡萄糖為主，還有少量的阿拉伯糖及木糖。這可能是由于綠豆淀粉在酸熱條件下降解后，以葡萄糖為主體進(jìn)行了重聚合，阿拉伯糖及木糖參與到了這一過程，共同形成了綠豆抗性糊精聚合體，而鼠李糖、甘露糖、半乳糖等未與葡萄糖發(fā)生聚合，在模擬移動(dòng)床色譜分離過程中被當(dāng)做雜糖分離出去，因此，在綠豆抗性糊精的單糖組成中沒有檢出。

3 結(jié)論

通過制備色譜評價(jià)、順序式模擬移動(dòng)色譜（SSMB）純化抗性糊精的技術(shù)研究，確定最佳技術(shù)參數(shù)為：進(jìn)料量455 g/h，進(jìn)水量682 g/h，循環(huán)量346 mL，出口折光24.6%，純度達(dá)到99.17%，收率達(dá)到91.31%。通過對純化后綠豆抗性糊精的分子特性的分析發(fā)現(xiàn)，綠豆抗性糊精的顆粒較大且大小不一，為不規(guī)則碎片，顆粒表面變得粗糙，為無定型結(jié)構(gòu)；經(jīng)酸熱處理后綠豆抗性糊精的化學(xué)鍵或官能團(tuán)沒有發(fā)生明顯變化；經(jīng)X 射線衍射測定發(fā)現(xiàn)綠豆抗性糊精為非晶態(tài)；綠豆抗性糊精的分子質(zhì)量大約在800 ku 左右；其單糖組成主要以葡萄糖為主，還有少量的阿拉伯糖及木糖。本研究可以有效地純化抗性糊精，為抗性糊精的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種高效的純化技術(shù)，此外，可以為我國抗性糊精的研究提供理論依據(jù)。