向 波 向 輝 熊 文 劉龍亞 印道春 王永杰 向 敏 符自清

吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院(湘西土家族苗族自治州人民醫(yī)院) 1 檢驗(yàn)科 2 腫瘤科 3 腎內(nèi)科 4 泌尿一科 5 皮膚科 ，湖南省吉首市 416000

自20世紀(jì)40年代，青霉素廣泛用作治療淋病的一線藥物以來，科研工作者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)對氨基糖苷類、β內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類和廣譜頭孢菌素類耐藥淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)[1]。更嚴(yán)重的是，NG泛耐藥(Extensively drug resistant, XDR)現(xiàn)象已經(jīng)出現(xiàn)，2018年英國和澳大利分別發(fā)現(xiàn)了本國首例XDR的NG菌株[2-3]。伴隨耐藥現(xiàn)象的是每年全球上億例淋病的高發(fā)病率。我國醫(yī)療和疾病控制系統(tǒng)對NG檢測力度仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及發(fā)達(dá)國家，盡管中國于1987年建立了淋球菌耐藥檢測系統(tǒng)(GASP)，但是絕大部分醫(yī)院沒有開展NG培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，因此國內(nèi)淋病疫情可能只是“冰山一角”。國內(nèi)僅江浙以及兩廣地區(qū)一些科研院所進(jìn)行小范圍科研工作，報(bào)道了少量頭孢菌素低敏和阿奇霉素耐藥的NG菌株[4-5]。在抗生素選擇性壓力下，具有強(qiáng)大耐藥特質(zhì)的NG必將出現(xiàn)頭孢菌素耐藥菌株，也將會(huì)給我國醫(yī)務(wù)工作者和衛(wèi)生管理者帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。故加強(qiáng)監(jiān)控淋病一線治療藥物頭孢曲松耐藥NG菌株流行狀況，進(jìn)一步闡明NG對頭孢菌素耐藥機(jī)理是淋病防治工作的重點(diǎn)之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)1例頭孢菌素耐藥菌株wls18099，進(jìn)一步檢測了與NG耐藥密切的penA、mtrR、penB和ponA基因相關(guān)信息[6-9]，進(jìn)行了penA基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，并研究了其耐藥分子機(jī)理和分子流行病學(xué)特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 耐藥菌株及藥敏實(shí)驗(yàn) 2018年9月，我們從武陵山區(qū)1名48歲有雙性接觸史的男性淋病患者尿道膿液中分離出1株頭孢克肟和頭孢曲松耐藥菌株(wls18099)。該患者無出國經(jīng)歷，口服200mg/bid頭孢克肟4周，治療失敗。治療期間無任何性接觸，但其性伴侶的性接觸史未知。之后，用單劑量160mg慶大霉素注射治療成功。1個(gè)月后，NG培養(yǎng)和NG-PCR復(fù)檢陰性。NG微生物學(xué)鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)，參照第28版CLSI M100。

1.2 NG-MAST分型、耐藥基因擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析 使用上海生工試劑盒(貨號(hào)B518255)提取NG基因組DNA。分子流行病學(xué)分析采用NG-MAST分型，引物：por，CAAGAAGACCTCGGCAA和CCGACAACCACTTGGT；tbpB，CGTTGTCGGCAGCG-CGAAAAC和TTCATCGGTGCGCTCGCCTTG。擴(kuò)增：95℃ 4min，95℃ 30s，por 58℃/tbpB 69℃各30s, 72℃ 1min,25個(gè)循環(huán),72℃10min。penA、mtrR、penB和ponA 4種與NG密切相關(guān)的重要耐藥基因PCR引物參照Liao M和Lee SG的數(shù)據(jù)[10-11]。PCR擴(kuò)增：引物0.5μl，模板0.5μl，酶0.5μl，鎂1.5mmol/L，dNTPs 200μmol/L；94℃4min，94℃40s，penA 58℃/mtrR 50℃/penB 46℃/ponA 56℃各40s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 6min。擴(kuò)增儀為ABI7500。電泳檢查產(chǎn)物，提取凝膠中DNA，送上海生工測序。使用BioEdit7.1.9比對這4種耐藥相關(guān)基因在wls18099和野生型菌株M32091之間的差異。

1.3 penA基因轉(zhuǎn)化分析 通過比對后，將wls18099菌株中存在差異的基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[12]。受體菌株為兩種標(biāo)準(zhǔn)菌株WHO M(MIC頭孢克肟≤0.016μg/ml、MIC頭孢曲松0.016μg/ml)、WHO L(MIC頭孢克肟0.25μg/ml、MIC頭孢曲松0.125μg/ml)以及一種臨床分離頭孢菌素敏感菌株wls11020(MIC頭孢克肟0.008μg/ml、MIC頭孢曲松0.016μg/ml)。設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并測定轉(zhuǎn)化后WHO M’、WHO L’和wls11020’菌株中penA、ponA、mtrR和penB序列，以排除轉(zhuǎn)化引起新的變異。最后測定3種轉(zhuǎn)化株對頭孢克肟和頭孢曲松的最小抑菌濃度(MIC頭孢克肟和MIC頭孢曲松)。

2 結(jié)果

2.1 wls18099耐藥菌株分子生物學(xué)信息 wls18099耐藥菌株NG-MAST分型，屬于ST14155。該菌株mtrR、penB和ponA基因序列與野生型菌株M32091比對，未發(fā)現(xiàn)新突變。我們在該菌株penA基因中，發(fā)現(xiàn)一種類似penA ⅩⅩⅩⅣ基因型的新鑲嵌等位基因型。其包含bp1507A/C與1508A/C顛換，并導(dǎo)致青霉素結(jié)合蛋白氨基酸序列K503P錯(cuò)義突變(賴氨酸→脯氨酸)，暫命名為penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P，見圖1。

圖1 頭孢菌素耐藥wls18099菌株和頭孢曲松敏感野生型M32091菌株間penA基因編碼蛋白PBP2氨基酸序列差異

2.2 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)前后3種菌株MIC值變化及4種基因特點(diǎn) wls18099菌株對頭孢克肟和頭孢曲松耐藥。WHO M、WHO L和wls11020轉(zhuǎn)化wls18099菌株penA基因后頭孢菌素類MIC值較轉(zhuǎn)化前上升4～62倍，詳見表1。WHO M、WHO L、wls11020和wls18099菌株por、tbpB、penA、ponA、mtrR和penB基因特點(diǎn)，詳見表2。轉(zhuǎn)化后WHO M’、WHO L’和wls11020’菌株除penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P位點(diǎn)改變，其余3種基因序列未產(chǎn)生新的變異。

表1 3種菌株轉(zhuǎn)化penAwls ⅩⅩⅩⅣ/K503P等位基因前后MIC值

表2 WHOM、WHOL、wls11020和wls18099菌株基因特點(diǎn)

3 討論

wls18099是湖南省首例頭孢菌曲松耐藥淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)，我們采用多抗原序列分型(NG-MAST)，探討了其分子流行病學(xué)特征。wls18099菌株與日本兵庫縣發(fā)現(xiàn)的KG12051菌株NG-MAST分型分別為ST14155和ST14150型，por基因型分別為ST8178型和ST8173型，二者tbpB基因型均為ST110型。生物信息學(xué)比對發(fā)現(xiàn)，二者por基因堿基序列差異<100bp，二者同屬于G1407基因群，兩株菌同源性極高[13]。盡管該基因群NG是歐洲和亞洲流行的頭孢曲松耐藥NG之一，但是2015年中國首先報(bào)道的該群菌株對頭孢曲松均敏感(MIC 0.008～0.06μg/ml)[13-15]。從上述報(bào)道的時(shí)間先后可以推測出我們發(fā)現(xiàn)的頭孢曲松耐藥菌株wls18099來源于國外的G1407基因群。眾所周知，擁有強(qiáng)大的基因重組和潛在的高度耐藥變異能力是NG的重要特性。很明顯，該群NG通過近幾年在國內(nèi)傳播，可能獲得了頭孢菌素類耐藥抗性的基因改變，導(dǎo)致其對頭孢菌素類敏感性由敏感轉(zhuǎn)化為耐藥。

NG對廣譜頭孢菌素(Extended spectrum cephalosporins，ESCs)產(chǎn)生耐藥主要與penA、mtrR、penB和ponA等基因突變相關(guān)。本課題組通過對wls18099耐藥株4種基因測序，發(fā)現(xiàn)penA基因出現(xiàn)一種特殊wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P鑲嵌突變，未在其余3種基因中檢出新突變。2015年國內(nèi)報(bào)道的4例G1407群NG菌株中，有3例頭孢曲松敏感菌株的penA基因型為ⅩⅩⅩⅣ型[15]。我們發(fā)現(xiàn)的頭孢曲松耐藥菌株wls18099與前述3例頭孢曲松敏感NG菌株差異在于，penA基因編碼蛋白PBP2發(fā)生了新的K503P改變。這提示我們，penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P等位基因型可能是導(dǎo)致wls18099菌株與其他頭孢菌素敏感NG菌株在藥敏表型上差異的主要原因。我們在國內(nèi)首次報(bào)道了這種新的penA鑲嵌等位基因，這也是本研究最重要的發(fā)現(xiàn)。

目前，已經(jīng)先后發(fā)現(xiàn)49種penA等位基因型，其中Ⅹ、ⅩⅩⅥ、ⅩⅩⅦ和ⅩⅩⅩ等都屬于鑲嵌基因型[11,16]。penA鑲嵌等位基因型具有較高的復(fù)雜性和多變性，其中涉及突變位點(diǎn)達(dá)到50余個(gè)。上述已知類型的鑲嵌等位基因型與耐藥有一定聯(lián)系，但無嚴(yán)格對應(yīng)關(guān)系[15]。因?yàn)?，不同NG菌株耐藥表型的差異不僅僅是蛋白質(zhì)一級(jí)序列的問題，還可能與編碼蛋白的基因組甲基化、基因誘導(dǎo)調(diào)控等表觀遺傳調(diào)控等協(xié)同因素相關(guān)。近年來，針對penA鑲嵌等位基因型的研究逐漸由Ⅹ轉(zhuǎn)向 ⅩⅩⅩⅣ型[7]。2018年Ryan L應(yīng)用whole-genome sequencing技術(shù)，在9例頭孢菌素低敏菌株中檢測出6例含有penA ⅩⅩⅩⅣ等位基因[17]。2018年，Washington在美國佐治亞州1名23歲士兵的尿道拭子中檢出了頭孢克肟耐藥菌株G093攜帶penA ⅩⅩⅩⅣ鑲嵌型等位基因型[8]。科研工作者們先后在舊金山、臺(tái)灣和加拿大發(fā)現(xiàn) ⅩⅩⅩⅣ型[18]，但是其對頭孢曲松和頭孢克肟僅僅表現(xiàn)為敏感性降低，MIC分別為0.06～0.125μg/ml和0.125～0.25μg/ml。本研究特殊之處在于，同樣包含penA ⅩⅩⅩⅣ基因型的wls18099具有更高水平的耐藥現(xiàn)象，頭孢曲松和頭孢克肟MIC分別為0.25μg/ml和1μg/ml。上述差異可能與wls18099菌株同時(shí)具有penA ⅩⅩⅩⅣ等位基因和一個(gè)未見報(bào)道的PBP2蛋白A503P氨基酸錯(cuò)義突變有關(guān)。賴氨酸A與脯氨酸P結(jié)構(gòu)和生理功能相差較大，我們據(jù)此假設(shè)，penA ⅩⅩⅩⅣ鑲嵌基因和PBP2蛋白A503P變異具有協(xié)同作用，共同導(dǎo)致wls18099菌株產(chǎn)生耐藥表型。

我們對penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P鑲嵌型等位基因認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。因此，我們在頭孢菌素耐藥wls18099菌株與2種標(biāo)準(zhǔn)菌株和1種頭孢菌素敏感菌株間分別進(jìn)行了penA基因水平轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，初步闡明了其對PBP2抗頭孢菌素類抗生素的活性。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)采用的受體菌株為WHO M、WHO L標(biāo)準(zhǔn)菌株以及臨床分離頭孢菌素敏感菌株wls11020。結(jié)果顯示，3種菌株轉(zhuǎn)化wls18099菌株penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P鑲嵌型等位基因后，均顯示出對頭孢克肟和頭孢曲松耐藥特征，且MIC值是轉(zhuǎn)化前的4～62倍。通過對上述3種受體菌株中其他主要耐藥基因測序(ponA、mtrR和penB)，明確了penA基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)沒有造成這3種基因序列產(chǎn)生新的變異，排除了這3種NG耐藥相關(guān)基因突變而引起耐藥性改變的干擾。這提示，wls18099耐藥菌株攜帶的penA ⅩⅩⅩⅣ/K503P鑲嵌基因型很可能是導(dǎo)致該菌株對頭孢菌素類抗生素穩(wěn)定地產(chǎn)生耐藥性的重要獨(dú)立因素。

綜上所述，我們于2018年首次在國內(nèi)分離出1例伴有K503P錯(cuò)義突變的penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P鑲嵌等位基因型的頭孢菌素類耐藥NG株wls18099。盡管penA ⅩⅩⅩⅣ鑲嵌基因型不是引起NG耐藥的唯一因素，但是本課題組通過penA基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)，前者在PBP2蛋白K503P改變的協(xié)同下，產(chǎn)生穩(wěn)定耐藥性。在后續(xù)研究中，我們將繼續(xù)監(jiān)測penA wls ⅩⅩⅩⅣ/K503P等位基因型，在湖南和周邊省份的播散情況，以控制頭孢菌素耐藥的wls18099菌株播散。