李紀(jì)遠(yuǎn) 馬 新 張燦斌 王 獻(xiàn) 鄭帥玉 王 強(qiáng)

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南省洛陽(yáng)市 471000

近二十年來(lái)，世界各地特別是美國(guó)、日本、中國(guó)和歐洲等國(guó)家胃遠(yuǎn)側(cè)部位腫瘤發(fā)生率呈顯著下降趨勢(shì)，而賁門癌發(fā)病率卻呈明顯上升趨勢(shì), 賁門癌發(fā)病隱蔽，分化程度低，侵襲性強(qiáng)，浸潤(rùn)范圍廣泛，賁門癌的5年生存率只有20%～30%[1]，對(duì)人類健康威脅很大。大量的研究數(shù)據(jù)表明，賁門癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是其主要的致死原因， 因此對(duì)其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的研究很有意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2011—2013年間賁門癌切除標(biāo)本136例，患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療，均經(jīng)病理證實(shí)為腺癌。其中男86例，女50例；年齡32～73歲，中位年齡56歲。術(shù)后病理檢查有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移75例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移61例；高分化24例，中分化26例，低分化86例。以42例癌旁組織為參照物。

1.2 主要試劑 Snail多克隆抗體購(gòu)自Abcom公司(17732)，E-cadherin多克隆抗體(ZM0092)、免疫組化SP試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 載玻片的處理：將載玻片用洗滌液浸泡，清洗干凈后，過(guò)兩遍蒸餾水，晾干。再放入泡洗液(濃硫酸250ml，重鉻酸鉀100g，蒸餾水750ml)中，浸泡24h，取出載玻片，流水沖洗干凈，烘干箱內(nèi)烤干載玻片。涂防脫片劑多聚賴氨酸，涂片范圍占載玻片的2/3，自然晾干備用。

1.3.2 組織標(biāo)本的取材和固定：手術(shù)切除標(biāo)本，取腫瘤組織約2cm×1.5cm×0.3cm大小，常規(guī)固定，石蠟包埋。

1.3.3 切片：連續(xù)切片，展開(kāi)后撈片，置烤箱中70℃烤片3h。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色步驟：S-P試劑盒原理：采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過(guò)氧化酶及底物色素混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞和組織切片中的抗原。染色的主要過(guò)程如下：(1)蠟切片常規(guī)脫蠟和水化。(2)每張切片滴加1滴3 %過(guò)氧化氫溶液(試劑A)，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性。(3)用PBS(pH 7.4)沖洗3次，3min/次。(4)高溫高壓組織抗原修復(fù)。(5)每張切片滴加1滴的非免疫動(dòng)物血清(試劑B)，室溫孵育10min。(6)甩去血清，每張切片滴加1滴一抗體，4℃過(guò)夜。(7)用PBS(pH 7.4)沖洗3次，3min/次。(8)每張切片滴加1滴或50μl的生物素標(biāo)記的二抗工作液(試劑C)，37℃溫箱孵育30min。(9)用PBS(pH 7.4)沖洗3次，3min/次。(10)每張切片滴加1滴鏈霉菌抗生物素—過(guò)氧化物酶溶液(試劑D)，37℃溫箱孵育30min。過(guò)氧化物酶使底物發(fā)生反應(yīng)，于反應(yīng)部位產(chǎn)生棕黃色沉淀物。(11)用PBS(pH 7.4)沖洗3次，3min/次。(12)每張切片滴加2滴新鮮配制的DAB，顯色3～10min。(13)沖洗，復(fù)染，分化，返藍(lán)，脫水，透明，封片。

1.4 結(jié)果判定 Snail陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以胞核出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性細(xì)胞，按染色強(qiáng)度的深淺積分，0分：無(wú)染色，1分：弱陽(yáng)性，2分：強(qiáng)陽(yáng)性。按著色細(xì)胞百分比，1分：1%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：76%～100%。然后按照陽(yáng)性細(xì)胞×染色強(qiáng)弱計(jì)積分，積分1～2為陰性，積分3～8為陽(yáng)性。E-cadherin陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以胞膜和(或)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性細(xì)胞，每例切片選擇高倍視野(×100),按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比分為陽(yáng)性與陰性：無(wú)陽(yáng)性著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<25%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥25%為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料以(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，表達(dá)相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Snail、E-cadherin賁門癌組織及癌旁組織中的表達(dá) 136例賁門癌組織Snail陽(yáng)性率72.8%,高于癌旁組織42.9%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Snail在癌旁組織中的表達(dá)主要見(jiàn)于輕中度不典型增生上皮，賁門癌組織E-cadherin的陽(yáng)性率36.7%，顯著低于癌旁組織85.7%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 賁門癌及癌旁組織中Snail蛋白及E-cadherin蛋白的表達(dá)

2.2 Snail與E-cadherin的表達(dá)與賁門癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及不同分化程度的關(guān)系 侵及黏膜層組Snail的陽(yáng)性表達(dá)率為29.4%，侵及肌層以上組Snail的陽(yáng)性表達(dá)率為62.7%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Snail在賁門癌的陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%，高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Snail在賁門癌的陽(yáng)性表達(dá)率32.8%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)，侵及黏膜層組E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率為79.4%，侵及肌層以上組E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率為52.0%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組E-cadherin在賁門癌的陽(yáng)性表達(dá)率為49.3%，明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Snail在賁門癌的陽(yáng)性表達(dá)率77.1%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Snail的陽(yáng)性表達(dá)率隨腫瘤分化程度的降低而升高，低分化組陽(yáng)性率顯著高于高、中分化組(P<0.05)；E-cadherin在賁門癌中的表達(dá)隨腫瘤分化程度的降低而降低，高、中分化組陽(yáng)性率相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于低分化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 賁門癌組織中Snail蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 賁門癌組織中Snail與E-cadherin表達(dá)的關(guān)系 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析示，隨著E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)減弱，Snail的陽(yáng)性表達(dá)明顯增高，兩者在賁門癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r<0,P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 賁門癌組織中Snail與E-cadherin表達(dá)之間的關(guān)系

3 討論

E-cadherin又稱為L(zhǎng)-CAM、CAM120/80、Arc-1，其基因位于人16號(hào)染色體長(zhǎng)臂16q22.1上，表達(dá)產(chǎn)物是一種相對(duì)分子質(zhì)量為120×103的Ca2+依賴性跨膜糖蛋白。上皮鈣黏附素E-cadherin普遍存在于各類上皮細(xì)胞，介導(dǎo)同型細(xì)胞連接，在維持正常上皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞極性及組織結(jié)構(gòu)完整性中發(fā)揮重要作用[2]，E-cadherin介導(dǎo)的黏附系統(tǒng)的破壞，是腫瘤從非浸潤(rùn)性轉(zhuǎn)化為浸潤(rùn)性的關(guān)鍵步驟[3]。 E-cadherin減少、喪失，以及異質(zhì)性、非極性分布使細(xì)胞間黏附力減弱，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞易于脫離原發(fā)灶而侵入到周圍組織和血管，繼而進(jìn)行擴(kuò)散。Kremer等[4]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型E-cadherin的瘤細(xì)胞生長(zhǎng)較對(duì)照細(xì)胞慢，且腫瘤轉(zhuǎn)移灶中E-cadherin表達(dá)完全喪失。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，人體惡性腫瘤細(xì)胞中E-cadherin常呈低表達(dá)。Sloan等[5]及Cheng等[6]報(bào)道E-cadherin低表達(dá)顯著與食管癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。這些研究證實(shí)E-cadherin的功能明顯影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，在賁門癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中可能起重要作用，并認(rèn)為是判斷賁門癌預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。

Snail是一類鋅指轉(zhuǎn)錄因子，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)它的高表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)而備受關(guān)注，E-cadherin被認(rèn)為是Snail的直接作用靶基因，轉(zhuǎn)錄因子Snail可與上皮鈣黏附因子E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)E-盒結(jié)合從而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄[7]，引起E-cadherin表達(dá)降低或缺損，從而導(dǎo)致上皮間連接的破壞。本實(shí)驗(yàn)表明，Snail高表達(dá)于賁門癌組織中，并與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)。同時(shí)也證實(shí)了Snail的高表達(dá)與E-cadherin的低表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這在很多上皮性腫瘤(包括鱗癌、肝癌、黑色素瘤等)[8-9]中也明顯存在反向表達(dá)。

在某些胚胎發(fā)育期起重要作用的基因常常在癌組織中被發(fā)現(xiàn)，提示它們可能參與一些啟動(dòng)腫瘤發(fā)生和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟， 其中Snail家族成員在此過(guò)程中發(fā)揮著主要作用。也就是說(shuō)，在胚胎發(fā)育中Snail在上皮細(xì)胞—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用被回憶。即Snail通過(guò)下調(diào)E-cadherin的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)發(fā)生EMT，EMT與腫瘤細(xì)胞的原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。筆者認(rèn)為，Snail使E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，使腫瘤細(xì)胞失去黏附，從原發(fā)灶脫落分離，且與上皮性腫瘤進(jìn)展過(guò)程中觸發(fā)EMT，即級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一步有關(guān)。從而向局部浸潤(rùn)、向淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，Snail與E-cadherin的聯(lián)合檢測(cè)可作為上皮性腫瘤惡性程度及預(yù)后的參考指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)Snail和E-cadherin對(duì)預(yù)測(cè)賁門癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有重要意義。Snail高表達(dá)和E-cadherin低表達(dá)可能是賁門黏膜惡性轉(zhuǎn)變及發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)標(biāo)志。Snail和E-cadherin的表達(dá)與分化程度、臨床病理分期存在相關(guān)性，可作為判斷食管癌進(jìn)展的重要標(biāo)志之一。從腫瘤發(fā)生的觀點(diǎn)來(lái)看，這不僅對(duì)理解腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移是重要的，同時(shí)又能充當(dāng)轉(zhuǎn)移潛能的標(biāo)志物，將會(huì)促進(jìn)對(duì)腫瘤的個(gè)性化治療的規(guī)劃。當(dāng)然，在非侵襲性腫瘤向侵襲性腫瘤發(fā)展過(guò)程存在著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，并且仍有許多問(wèn)題不甚明確，這些復(fù)雜的機(jī)制需要我們進(jìn)一步去深入的探討和研究，希望能夠?yàn)樯掀ば阅[瘤的診斷治療提供更有利的理論依據(jù)，這也勢(shì)必成為腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的新熱點(diǎn)。