湯國謙，鄧雪華，華展義，鄭曉薇，牟桂萍，劉淑君，王新國

(黃埔海關(guān)技術(shù)中心，東莞 523000)

薇甘菊MikaniamicranthaKunth，也稱小花蔓澤蘭或小花假澤蘭,是菊科多年生草本植物或灌木狀攀緣藤本。薇甘菊原產(chǎn)于南美洲和中美洲，現(xiàn)已廣泛傳播到亞洲熱帶地區(qū)，如印度、馬來西亞、泰國、印度尼西亞、尼泊爾、菲律賓、巴布亞新幾內(nèi)亞、所羅門、印度洋圣誕島和太平洋上的一些島嶼，包括斐濟、西薩摩亞、澳大利亞北昆士蘭地區(qū)，成為當(dāng)今世界熱帶、亞熱帶地區(qū)危害最嚴(yán)重的雜草之一(許少嫦等，2013)。薇甘菊早在1919年便已在香港出現(xiàn)，1984年在深圳已采到它的標(biāo)本(孔國輝等，2000)，2000年時已在珠江三角洲廣泛擴散(昝啟杰等，2000)。目前該種已列入世界上最有害的100種外來入侵物種之一(袁家祥和張惠嬌，2017)，也列入中國首批外來入侵物種。2017年，面對著不斷漫延擴張的薇甘菊，深圳市政府不得不組織上百人在沙河公園進(jìn)行人工清除。

有關(guān)薇甘菊在入侵地的天敵，目前我國已報道的種類有頸盲蝽Pachypehissp.(王大偉等，2016)；馬來西亞曾記錄了薇甘菊上發(fā)現(xiàn)的昆蟲有4目11種，在薇甘菊原產(chǎn)地的天敵則有昆蟲3目5種(韓詩疇等，2001)。近日，我們還在廣州的薇甘菊上發(fā)現(xiàn)了另一種蝽類昆蟲——亞銅平龜蝽Brachyplatyssubaeneus(Westwood, 1837) (圖1)。

圖1 薇甘菊上的亞銅平龜蝽Fig.1 Brachyplatys subaeneus on Mikania micrantha

據(jù)報道，亞銅平龜蝽在入侵巴拿馬時被誤鑒定為其近似種亞黑平龜蝽Brachyplatysvahlii(Fabricius, 1787)，后來Rédei專門發(fā)文澄清其應(yīng)為亞銅平龜蝽，并在文中展示了這兩種平龜蝽昆蟲的外形圖，闡明了亞銅平龜蝽的特征是前胸背板和盾片基部沒有成對的小圓形淺斑，腹側(cè)前緣至體側(cè)具細(xì)窄的黃色緣邊，腹側(cè)上的黃色緣邊不超過各個腹側(cè)總寬度的十分之一(Rédei，2016)。Rédei還在文中圖示了亞銅平龜蝽的雄性陽莖特征，但其所描述的是從生理解剖學(xué)上手繪的生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，是一種為展示其完全結(jié)構(gòu)人為展開后的形態(tài)結(jié)構(gòu)，與雄性陽莖堿解后的原始結(jié)構(gòu)有相當(dāng)大的差異。而另一龜蝽分類資料(薛懷君，2001)，也僅提供了簡單的手繪圖。不過，Rédei在文中確認(rèn)了GenBank登錄號為AB240166.1和KT447151.1的物種分別為亞黑平龜蝽和亞銅平龜蝽，但GenBank登錄號為AB240167.1的物種不確定是否為亞銅平龜蝽。因此，為進(jìn)一步確定該種龜蝽種類，本文對其做了形態(tài)學(xué)描述，還采用了分子生物學(xué)方法進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

取生長在廣州薇甘菊上的龜蝽雌、雄成蟲若干頭于標(biāo)本管中，置于-20℃冰箱，待其死亡后置于顯微鏡下觀察和解剖。

1.2 主要儀器和工具

蔡司V8立體顯微鏡(帶CCD)；ThermoFisher Multiskan GO酶標(biāo)儀；Biometra TProfessional Trio 48多槽梯度PCR儀；上海天能Tanon 3500凝膠成像儀；北京六一DYY-6C型電泳儀；鑷子；解剖針等。

1.3 主要試劑

5% NaOH溶液；TIANGEN微量組織提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；引物和PCR反應(yīng)試劑Taq PCR Master Mix，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察

將雌、雄龜蝽置于純石英砂表面上，在立體顯微鏡下觀察和記錄其各部位結(jié)構(gòu)特征，并拍照保存。

1.5 雄性生殖器解剖

把雄性龜蝽腹部取下，在質(zhì)量百分比為5% NaOH溶液中煮10 min后，再放入清水中煮沸10 min，最后再放入另一沸水中清洗，待清水自然涼至室溫后取出，置于載玻片上解剖，取出目標(biāo)結(jié)構(gòu)，置于預(yù)先滴好甘油的玻片上制成玻片，在立體顯微鏡下觀察和記錄，并拍照保存。

1.6 基因組DNA提取、擴增和測序

基于線粒體基因組的DNA條形碼分子鑒定技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲的分子鑒定中(Sharmaetal.，2014；Khadem and Mahnaz，2015；Huaetal.，2016)，在蝽科分類研究中也有較多的應(yīng)用(李紅梅等，2006；梁秋英等，2009；Wuetal.，2018)。本文選取線粒體基因組上的16S rDNA和COI兩個基因片段，通過對Rédei論證的兩種平龜蝽的16S rDNA序列(GenBank登錄號為AB240166.1和KT447151.1)的檢索和分析，應(yīng)用NCBI的Primer-BLAST工具設(shè)計引物Bra_F(5′-CCGAAACTGCAAGGGATATCAT-3′)/Bra_R(5′-GCACAGTCAAAATACTGCGGC-3′)，用于區(qū)分這兩種平龜蝽屬昆蟲，并用COI_F(5′-CAACATTTAT TTTGATTTTTTGG-3′)/COI_R(5′-TCCAATGCAC TAATCTGCCATATTA-3′)(Simonetal.，1994)輔助鑒定。

取龜蝽成蟲肌肉較多的兩條后足于1.5 mL離心管中，75%酒精消毒晾干后，用研磨棒將其充分研磨破碎，按試劑盒操作提取DNA并測定其濃度和純度，用作PCR模板。PCR反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 12.5 μL；上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL；模板DNA 1 μL；無菌水定容至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，反應(yīng)35個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，將PCR產(chǎn)物寄往廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司雙向測序，測序引物采用各自擴增引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

雄蟲體長4.5～4.8 mm，背面觀通體黑色，僅足和觸角為黃褐色；前胸背板和小盾片具淡黃色緣邊；成蟲頭部中央?yún)^(qū)有4條短縱條紋，在縱條紋上下兩側(cè)各有兩條黃色橫條紋，有時橫條紋會與外側(cè)縱條紋相連結(jié)(圖2-C)；腹面觀，前 2節(jié)腹節(jié)外側(cè)上有黃色斑紋后面3節(jié)僅余十分短小的痕跡(圖2-D)；第6腹節(jié)與前部結(jié)合不緊密，能活動，常會突出于小盾片之外(圖2-C，D)；第6腹節(jié)呈半圓形，上有兩個深凹陷，中央有一長方形突起，突起兩邊為各有1個豆芽狀抱握器(圖3-B，C，D)；抱握器中部膨脹部，且生有大量排列整齊的長毛(圖3-A)。

雌蟲體形稍大，長約4.8～5.2 mm；其腹部腹節(jié)從前到后都有黃色斑紋，不過從前到后逐漸變短；第6可見腹節(jié)呈近三角形，上有橫向排列的兩個淺凹陷(圖2-B)；除此之外，其他特征與雄蟲相同。

圖2 亞銅平龜蝽成蟲形態(tài)Fig.2 Adult form of Brachyplatys subaeneus注：A, 雌蟲背面觀；B, 雌蟲腹面觀；C, 雄蟲背面觀；D, 雄蟲腹面觀。Note: A, female, dorsal view; B, female, ventral view; C, male, dorsal view; D, male, ventral view.

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果分析

通過擴增該蟲線粒體中的16S rDNA和COI兩個基因片段，凝膠電泳成像顯示，擴增所得片段長度基本符合預(yù)期(圖4)。

擴增產(chǎn)物雙向測序結(jié)果用MEGA 5.0軟件拼接得到的16S rDNA和COI基因有效序列長度分別為425 bp、779 bp，與GenBank中的序列進(jìn)行比對，該蟲16S rDNA和COI序列分別與GenBank登錄號為KT447151.1和MF162956.1的亞銅平龜蝽序列相似性均超過99%(表1)。

分別下載GenBank中圓龜蝽屬Coptosoma和豆龜蝽屬Megacopta各兩個種、亞銅平龜蝽以及亞黑平龜蝽的16S rDNA序列，與擴增所得基于16S rDNA序列在MEGA 5.0軟件中用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)、各分支置信度(bootstrap)進(jìn)行1 000次以上重復(fù)檢驗，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，該蟲與亞銅平龜蝽聚于同一物種分支上。

圖4 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products注：1, COI擴增條帶；2, 16S rDNA擴增條帶；3, Marker。Note: 1, COI gene amplification band; 2, 16S rDNA gene amplification band; 3, Marker.

表1 GenBank中序列比對結(jié)果

圖5 基于16S rDNA部分序列以鄰接法構(gòu)建的亞銅平龜蝽系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenic tree of Brachyplatys subaeneus constructed with Neighbor-Joining method based on 16S rDNA partial sequence注：“Bra”即廣州薇甘菊上的龜蝽。Note: ‘Bra’ is the Plataspidae on Mikania micrantha in Guangzhou.

3 結(jié)論與討論

經(jīng)形態(tài)觀察，薇甘菊上的這種龜蝽科昆蟲個體較小，雌蟲(圖2-A，B)較雄蟲(圖2-C，D)略大，形態(tài)特征也略有區(qū)別，與亞銅平龜蝽的形態(tài)特征較為相似，但之前亞銅平龜蝽多次被誤鑒定為其近似種亞黑平龜蝽(Hosokawaetal., 2006；Aielloetal., 2016)，因此Rédei發(fā)文提供了牛津大學(xué)博物館和丹麥哥本哈根大學(xué)自然歷史博物館的鑒定資料，所述亞銅平龜蝽的分類特征：前胸背板和盾片基部沒有成對的小圓形淺斑，腹側(cè)前緣至體側(cè)具細(xì)窄的黃色緣邊，腹側(cè)上的黃色緣邊不超過各個腹側(cè)總寬度的十分之一(Rédei，2016)，與本次薇甘菊上的龜蝽科昆蟲的形態(tài)特征基本相符，而與Rédei提供的亞黑平龜蝽鑒定資料有明顯的區(qū)別。此外，通過對雄蟲陽莖結(jié)構(gòu)進(jìn)行堿解，其堿解后的結(jié)構(gòu)(圖3)與原始結(jié)構(gòu)均有很大的差異，較手繪圖更為直觀，為該蟲的準(zhǔn)確鑒定提供了更多素材。

在分子層面，Rédei在文中對GenBank中的誤鑒定為亞黑平龜蝽的幾條序列作了進(jìn)一步的論述，根據(jù)之前誤鑒定的文獻(xiàn)(Hosokawaetal., 2006；Aielloetal., 2016)圖片資料，確定登錄號為KT447151.1 和KT447152.1的序列應(yīng)為亞銅平龜蝽，AB240166.1應(yīng)為亞黑平龜蝽，AB240167.1則未能明確其物種(Rédei，2016)。本文為了區(qū)分這兩種平龜蝽屬昆蟲，設(shè)計了一對引物，擴增該蟲的16S rDNA片段進(jìn)行輔助鑒定，擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與亞銅平龜蝽序列KT447151.1相似性超過99%(表1)，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，該蟲也與亞銅平龜蝽聚于同一物種分支上(圖5)。

通過形態(tài)學(xué)特征結(jié)合分子生物學(xué)方法分析，并參考Rédei的論證，可以確定在廣州的薇甘菊上發(fā)現(xiàn)的龜蝽為亞銅平龜蝽Brachyplatyssubaeneus(Westwood, 1837)。此外，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)可知，Rédei文中未能確定物種的AB240167.1(Rédei，2016)也與亞銅平龜蝽聚于同一物種分支上，初步判斷AB240167.1很可能也是亞銅平龜蝽，需要通過形態(tài)學(xué)特征才能最終明確。

相關(guān)資料顯示，亞銅平龜蝽是華南地區(qū)廣泛分布的一種蝽類。最早記載其主要寄主為豆科作物(袁鋒，1996)。近二十多年來，隨著薇甘菊在華南地區(qū)的廣泛分布，一些本地昆蟲開始習(xí)慣于取食這一外來植物。據(jù)我們觀察，目前在廣州薇甘菊上取食的本地昆蟲有繡線菊蚜AphiscitricolaVan der Goot、紫紅短須螨Brevipalpusphoenicis、亞銅平龜蝽、緣紋廣翅蠟蟬Ricaniamarginali(Walker, 1851)，一種角蟬和一種蝸牛。從對單株薇甘菊的控制作用來看，繡線菊蚜蟲最明顯，感染蚜蟲的薇甘菊梢部發(fā)育不良，生長緩慢，扭曲畸形，但由于頻繁雨水和瓢蟲的控制作用，在成片薇甘菊調(diào)查中發(fā)現(xiàn)蚜蟲感染的植株較為有限；紫紅短須螨則取食薇甘菊葉片，導(dǎo)致葉片變形和葉片背面逐漸變褐、變黃，紫紅短須螨數(shù)量多時，莖葉均嚴(yán)重受害，葉片縮小，葉背硬化變脆，但該螨蟲還對柑桔、西番蓮、番木瓜等有一定危害(陳瑞屏等，2003)；緣紋廣翅蠟蟬則為廣食性，不僅取食薇甘菊，也取食周圍存在的臭雞屎藤、芒果、桉樹、天竺桂等植物上，因此僅起到輕微控制作用；另外一種角蟬和小型蝸牛也僅是偶爾取食薇甘菊，對其控制作用可以忽略不計。

與繡線菊蚜和紫紅短須螨相比，亞銅平龜蝽對微甘菊單個嫩梢的控制作用相對較弱，但其對成片的薇甘菊有高的感染率。亞銅平龜蝽主要以若蟲聚集于近梢部吸取汁液。在一處薇甘菊覆蓋幾乎成為單一植物種群的地方，目測調(diào)查了50根薇甘菊嫩梢，發(fā)現(xiàn)亞銅平龜蝽對薇甘菊的嫩梢感染率達(dá)到50%以上，即一叢薇甘菊的嫩梢上，大部分都會被龜蝽感染；進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，亞銅平龜蝽主要集中于薇甘菊從梢部倒數(shù)第4對葉片以上處進(jìn)行取食，且主要集中于葉柄附近的莖干部；一般1根梢部有蟲7～12頭，多的可達(dá)30頭以上，平均約為20頭。同一根梢上會混生有1～4齡若蟲及成蟲，世代發(fā)育很不整齊；卵聚產(chǎn)，一般一處為12～14個。亞銅平龜蝽主要依靠成蟲擴散，成蟲飛翔能力較強。由于亞銅平龜蝽體型光滑，背部堅硬，因此一般的昆蟲天敵類如螞蟻、蜘蛛、螳螂等都難以捕食，其主要的天敵為一種卵寄生蜂。另外，與其他取食薇甘菊的昆蟲相比，在堅硬光滑的體表保護(hù)下的亞銅平龜蝽更耐受南方春季的大雨天氣，一般雨水對其種群數(shù)量影響不大。從這幾個方面看來，亞銅平龜蝽對薇甘菊為害具有較強的控制能力。因此，作為一種有潛力的天敵昆蟲，有必要進(jìn)一步開展亞銅平龜蝽在薇甘菊控制方面的研究。