郭麗娜，趙慧婷，任有蛇，徐 兵，姜玉鎖*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，山西太谷 030801； 3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，山西太谷 030801)

中華蜜蜂Apisceranacerana是我國(guó)特有的蜜蜂品種，其善于利用零星蜜粉源，對(duì)我國(guó)山區(qū)和低溫開花植物授粉有著極其重要的作用，而中華蜜蜂傳粉行為與其嗅覺系統(tǒng)中的相關(guān)蛋白的功能有著密切的關(guān)系。蜜蜂的嗅覺系統(tǒng)是需要多種蛋白分子參與的復(fù)雜的化學(xué)信號(hào)通訊過(guò)程，其嗅覺感知起始于特異性的氣味受體(Olfactor Receptor, ORs)蛋白與氣味分子的結(jié)合后激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，打開離子通道，從嗅覺感覺神經(jīng)元向大腦發(fā)送電信號(hào)并產(chǎn)生氣味相關(guān)動(dòng)作電位。Kriger等最早發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂ApismelliferaAmelR2與果蠅DrosophilaOr83b和岡比亞按蚊AnophelesgambiaeAgOr7同源，表達(dá)于意蜂觸角毛型感器和板形感器中(Kriegeretal., 1999; Liuetal., 2013)。隨后，Liu等從意大利蜜蜂A.mellifera全基因組中鑒定出177個(gè)ORs(Liuetal., 2012)，Wanner等從東方蜜蜂Apiscerana全基因組鑒定出119個(gè)ORs(Wanneretal., 2007)。和其他的昆蟲相比，蜜蜂擁有較多種類的氣味受體基因，這可能與蜜蜂群體內(nèi)化學(xué)通訊及蜜蜂和花之間的化學(xué)通訊存在著密切的關(guān)系(Miuraetal., 2009)。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)下同源靶基因mRNA被特異地降解，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后靶基因表達(dá)沉默，引起相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象。該技術(shù)已成為研究基因功能的重要工具，具有高效、快速、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)(Uryuetal., 2013; 馮小艷和張樹珍, 2017)。在蜜蜂中，該技術(shù)已經(jīng)在調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)、級(jí)型分化、病蟲害防治中進(jìn)行了大量的研究。調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)方面：Beye等(2002)首次在蜜蜂上應(yīng)用RNAi技術(shù)成功阻斷了E30靶基因在整個(gè)胚胎中的表達(dá)。隨后，Gatehouse等(2004)通過(guò)對(duì)采集蜂注射dsRNA能使其咽下腺的淀粉酶活性顯著降低。Amdam等(2006)通過(guò)RNAi技術(shù)下調(diào)蜜蜂卵黃蛋白基因的表達(dá)水平導(dǎo)致工蜂味覺反應(yīng)增強(qiáng)。Costa等(2017)敲除意大利蜜蜂鞣化激素基因AmBursα和AmBursβ能阻止表皮的黑化和硬化過(guò)程。級(jí)型分化方面：Aronstein等(2006)證實(shí)沉默蜜蜂跨膜蛋白Sid-1表達(dá)后，結(jié)果使蜜蜂大量死亡和形態(tài)發(fā)生變異。Patel等(2007)發(fā)現(xiàn)敲除蜜蜂營(yíng)養(yǎng)能量感應(yīng)激酶TOR(target of rapamycin)基因能阻止幼蟲發(fā)育成蜂王。Kucharski等(2008)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt3能破壞剛孵化的蜜蜂幼蟲朝蜂王方向的發(fā)育，從而決定幼蟲發(fā)育方向。防治蜜蜂病毒病方面：Maori等(2009)發(fā)現(xiàn)飼喂意蜂以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV) dsRNA能夠使IAPVA表達(dá)受到抑制，阻止蜂群崩潰失調(diào)病(CCD)的發(fā)生。Desai等(2012)以蜜蜂畸翅病毒(Deformed Wing Virus，DWV)為靶標(biāo)，飼喂幼蟲和成蜂dsRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)能顯著降低死亡率和畸翅癥狀。Zhang等(2016)對(duì)感染中蜂囊狀幼蟲病(Chinese sacbrood virus, CSBV)的幼蟲進(jìn)行RNAi研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，飼喂中蜂幼蟲CSBV結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因dsRNA后，能顯著降低中蜂幼蟲死亡率。以CSBV RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)基因?yàn)榘袠?biāo)干擾結(jié)果更顯著，幼蟲死亡率更低(史紅霞等，2019)。

本課題組之前的研究從中華蜜蜂中克隆并鑒定出1個(gè)傳統(tǒng)的氣味受體ORs(conventional receptors)基因AcerOr1(GenBank登錄號(hào)：JN 792580)，在工蜂和雄蜂不同發(fā)育階段的觸角中均能夠檢測(cè)到表達(dá)(趙慧婷，2013)。蜜蜂的氣味受體在其采集食物、親屬辨認(rèn)、工蜂監(jiān)督和防御等行為上起著重要的作用(Hallemetal., 2006)，但是與其他昆蟲如果蠅和蚊子等相比，有關(guān)蜜蜂Ors功能的研究很少，因此本研究通過(guò)構(gòu)建相應(yīng)的AcerOr1基因干擾質(zhì)粒，并篩選出最佳的干擾序列，為進(jìn)一步研究AcerOr1的功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試蜜蜂

中華蜜蜂Apisceranacerana飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中蜂實(shí)驗(yàn)場(chǎng)。取封蓋子脾放置于人工氣候箱(溫度32℃、RH 65% ±5%)，待出房后將蜜蜂放置于飼喂盒(10 cm×5 cm)中，將培養(yǎng)箱溫度調(diào)整為28℃，濕度不變。

1.1.2主要試劑、菌株、質(zhì)粒

Trizol?Reagent、PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit和SYBR SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit購(gòu)自TaKaRa；JM109、T7 RiboMAXTM Express RNAi System試劑盒、Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒和pGEM?-T Easy載體購(gòu)自Promega；EcoRI和BamHI購(gòu)自NEB；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega；Plasmid Mini Kit購(gòu)自康為世紀(jì)；感受態(tài)細(xì)胞TOP10、昆蟲細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自生工；辣根過(guò)氧化物酶酶標(biāo)羊抗兔β-actin、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光底物等購(gòu)自Boster；AcerOr1多克隆抗體購(gòu)自北京京成天脈。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1AcerOr1基因dsRNA的合成

以NCBI上AcerOr1(JN792580)和GFP(JQ064510.1)基因CDS區(qū)為模板，使用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)3個(gè)不同片段大小的引物(見表1)，并在引物5′端添加T7啟動(dòng)子序列：TAATACGACTCACTATAGGG。以克隆測(cè)序后含有目的基因AcerOr1部分序列的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min)。使用Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物定量，使其滿足體外合成dsRNA的量。根據(jù)T7 RiboMAXTM Express RNAi System試劑盒操作手冊(cè)使用T7 RNA聚合酶將上述回收的DNA產(chǎn)物體外合成dsRNA，濃度測(cè)定后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 AcerOr1 dsRNA合成和mRNA表達(dá)分析所需引物

1.2.2中華蜜蜂飼喂dsRNA實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置dsAcerOr1-1，dsAcerOr1-2，dsAcerOr1-3 3個(gè)處理組和dsGFP1個(gè)對(duì)照組。新羽化出房的蜜蜂置于飼喂盒中饑餓處理(排便)2 d，使用移液槍對(duì)蜜蜂進(jìn)行dsRNA飼喂，每頭蜜蜂飼喂10 μg dsRNA，對(duì)照組飼喂等量dsGFP，每組飼喂30頭，飼喂后的蜜蜂置于(溫度28℃，RH 65%±5%)恒溫箱中飼養(yǎng)。每天更換新鮮飼料。

1.2.3干擾效果檢測(cè)

(1)qPCR檢測(cè)干擾效果

采集飼喂dsRNA后4日齡的蜜蜂液氮速凍，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行qPCR檢測(cè)飼喂dsRNA后蜜蜂體內(nèi)AcerOr1表達(dá)情況。(qPCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物(20 mM)各0.8 μL，SYBR Green Premix 10 μL，Rox 0.4 μL，ddH2O 6 μL。擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，57℃ 40 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min，35個(gè)循環(huán))(所用引物見表1)。

(2)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)干擾效果

采用昆蟲細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，以每孔上樣蛋白量20 μg進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，半干轉(zhuǎn)膜儀將分離膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)，TBST洗膜3次，每次10 min。用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。TBST稀釋的一抗AcerOr1(1 ∶1 000)4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min。TBST稀釋的二抗驢抗兔IgG室溫溫育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min ECL顯色。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)方法采用T-test(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 dsRNA模板合成檢測(cè)

以中華蜜蜂氣味受體基因AcerOr1(JN792580)和GFP(JQ064510.1)全長(zhǎng)為模板，克隆得到含有T7啟動(dòng)子的AcerOr1和GFP基因片段后，測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果顯示(圖1，圖2)：氣味受體AcerOr1的3個(gè)大小不同片段的dsRNA合成模板和GFP的1個(gè)dsRNA合成模板均已加上T7啟動(dòng)子(綠色)，該產(chǎn)物可以回收用于下一步dsRNA合成。

2.2 體外合成的dsRNA檢測(cè)

將合成的大小不同片段的dsRNA經(jīng)濃度檢測(cè)顯示均在8～10 μg/μL之間，隨后各取1 μL 10倍稀釋后電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示：體外合成的中華蜜蜂AcerOr1(1-3)和GFP(7)的dsRNA片段大小與目標(biāo)片段大小一致，可用于后續(xù)的基因沉默。

2.3 最佳干擾片段篩選

qPCR檢測(cè)不同片段的干擾效果，結(jié)果如圖4所示：飼喂大小不同的3個(gè)dsRNA片段后對(duì)中華蜜蜂AcerOr1基因的表達(dá)干擾效果不同。飼喂429 bp dsAcerOr1-1組與對(duì)照組(dsGFP)相比，AcerOr1基因表達(dá)量之間不具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P>0.05)，而飼喂218 bp的dsAcerOr1-2組和543 bp的dsAcerOr1-3的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，AcerOr1基因表達(dá)量均有顯著的抑制，抑制率分別為88.85% ±0.12%和69.16% ±1.06%(P<0.05)。用Western blot進(jìn)一步檢測(cè)不同片段干擾效果，結(jié)果如圖5所示：與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致，與對(duì)照組相比，飼喂dsAcerOr1-1片段后沒有變化，而飼喂dsAcerOr1-2后AcerOr1蛋白的表達(dá)量受到顯著抑制(P<0.05)，綜合上述RNA檢測(cè)結(jié)果，合成的dsRNA干擾片段在蛋白和RNA水平均能干擾AcerOr1的表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

將外源dsRNA順利導(dǎo)入細(xì)胞是誘發(fā)RNAi效應(yīng)成功的關(guān)鍵。將外源dsRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)并誘發(fā)RNAi常用的方法主要有浸泡法、注射法、飼喂法等(Xiongetal., 2013；Sapountzisetal., 2014)。其中飼喂法最先是由Fire研究小組發(fā)現(xiàn)，通過(guò)飼喂線蟲C.elegans表達(dá)dsRNA的大腸桿菌可以誘發(fā)RNA干擾效應(yīng)(Timmons and Fire, 1998)。隨后在蟋蟀Gryllusbimaculatus(Meyeringvos and Müller, 2007)、白蟻Reticulitermesflavipes(Zhouetal., 2008)、意大利蜜蜂Apismellifera(Nunes and Sim?es, 2009)等多種昆蟲上都通過(guò)飼喂法成功干擾相關(guān)基因的表達(dá)。本研究采用飼喂法并誘發(fā)中華蜜蜂體內(nèi)氣味受體RNA干擾效應(yīng)，以期為中華蜜蜂AcerOr1基因功能研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 中華蜜蜂AcerOr1 dsRNA模板Fig.1 dsRNA templates based on genes from AcerOr1 of Apis cerana cerana注：A，B，C分別為片段大小為429 bp，218 bp，543 bp的dsAcerOr1模板(圖中綠色區(qū)域?yàn)橐飪啥思由系腡7啟動(dòng)子序列)。Note: A, B and C are respectively for the fragment size of 429 bp, 218 bp and 543 bp dsAcerOr1 template (green areas for primer T7 has the promoter sequences on both ends).

圖2 GFP dsRNA模版Fig.2 dsRNA templates based on genes from GFP注：片段大小為625 bp(圖中綠色區(qū)域?yàn)橐飪啥思由系腡7啟動(dòng)子序列)。Note: The fragment size of 625 bp (green areas for primer T7 has the promoter sequences on both ends).

圖3 體外合成dsRNAFig.3 dsRNA synthesized in vitro注：Marker，蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1～3分別為片段大小為體外合成的429 bp，218 bp，543 bp的dsAcerOr1片段；4～6為體外合成的dsAcerOr2片段；7為體外合成的dsGFP片段。Note: Marker, Protein molecular weight marker; 1～3, The fragment with the size of 429 bp, 218 bp and 543 bp of dsAcerOr1 synthesized in vitro; 4～6,The fragments of dsAcerOr2 synthesized in vitro. 7, The fragments of dsGFP synthesized in vitro.

圖4 飼喂中華蜜蜂不同大小片段dsAcerOr1對(duì)AcerOr1mRNA表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of different sizesof ds AcerOr1 on the expression of AcerOr1 mRNA in Apis cerana cerana

圖5 飼喂中華蜜蜂不同大小片段dsAcerOr1對(duì)AcerOr1蛋白表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of different sizes of dsAcerOr1 on the expression of AcerOr1 protein in Apis cerana cerana

許多研究證明長(zhǎng)鏈dsRNA較短鏈dsRNA在昆蟲中干擾效果更明顯。例如在對(duì)果蠅Drosophila胚胎的RNA干擾中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)度為300～1 000 bp的dsRNA干擾活性最大，且RNAi干擾效果隨dsRNA鏈的增長(zhǎng)增強(qiáng)(Wicheretal., 2008)。而對(duì)于同源性很高的基因，長(zhǎng)鏈dsRNA則可能造成非靶標(biāo)基因沉默的現(xiàn)象，這時(shí)短鏈dsRNA的干擾效果最好。本研究對(duì)中華蜜蜂氣味受體AcerOr1設(shè)計(jì)并合成了3個(gè)不同大小的dsRNA片段進(jìn)行RNAi，結(jié)果顯示，218 bp的短鏈dsRNA沉默效果最好，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所選的基因dsRNA片段大小對(duì)RNAi作用效果明顯。

特異性是RNAi的關(guān)鍵問(wèn)題，dsRNA能否真正破壞靶基因的表達(dá)，靶基因的沉默是否是由于dsRNA引起的值得我們研究。本試驗(yàn)從以下幾個(gè)方面來(lái)解決該問(wèn)題。(1)飼喂dsGFP做對(duì)照組。GFP是在水母中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，中華蜜蜂體內(nèi)沒有該蛋白質(zhì)，所以在昆蟲RNAi中常被用作對(duì)照，以排除核酸本身對(duì)中華蜜蜂的影響；通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)目的基因表達(dá)量下降確實(shí)是飼喂目的基因dsRNA引起，而不是由飼喂外源基因dsRNA而引起的。(2)Western blot定量檢測(cè)干擾后中華蜜蜂體內(nèi)AcerOr1蛋白表達(dá)量。與對(duì)照組相比，干擾后實(shí)驗(yàn)組中華蜜蜂體內(nèi)AcerOr1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降，而內(nèi)參β-actin蛋白相對(duì)表達(dá)量沒有發(fā)生變化，說(shuō)明內(nèi)源性目的基因AcerOr1表達(dá)被特異性抑制，而不是由于其他基因的沉默所導(dǎo)致。

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)飼喂中華蜜蜂dsRNA介導(dǎo)體內(nèi)RNAi的試驗(yàn)，干擾氣味受AcerOr1基因體內(nèi)表達(dá)，在mRNA和蛋白水平對(duì)干擾效果進(jìn)行了初步檢測(cè)，結(jié)果顯示飼喂dsAcerOr1后能顯著降低中華蜜蜂體內(nèi)AcerOr1mRNA和蛋白表達(dá)水平，為后續(xù)進(jìn)一步研究中華蜜蜂氣味受體基因AcerOr1功能打下了基礎(chǔ)。