唐倩，陳絲，歐淑瓊，李勤，李娟*，王坤波*

茶樹原核表達(dá)及酶促條件優(yōu)化

唐倩1,2,4，陳絲1,2,4，歐淑瓊1,2,4，李勤1,2,3,4，李娟1,2,3,4*，王坤波1,2,3,4*

(1.國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2.茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3.植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長沙 410128)

優(yōu)化了重組茶樹咖啡酰輔酶A--甲基轉(zhuǎn)移酶基因()在大腸桿菌中的表達(dá)，采用Ni-NTA親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)為底物，進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，采用HPLC測定反應(yīng)產(chǎn)物EGCG3"Me的生成量。結(jié)果表明，在BL21中能夠高效表達(dá)，最優(yōu)條件為誘導(dǎo)溫度37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間4 h，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)濃度0.5 mmol/L；重組蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析柱梯度洗脫達(dá)到了較好的純化效果；重組酶在體外能夠催化EGCG，合成EGCG3"Me，底物EGCG最佳濃度為0.05 mmol/L，最適溫度為37 ℃，最適pH值為4。

茶樹；咖啡酰輔酶A--甲基轉(zhuǎn)移酶；原核表達(dá)；純化；酶促合成

咖啡酰輔酶A--甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)是一類S-腺苷-L-甲硫氨酸( SAM )甲基轉(zhuǎn)移酶，它能催化類黃酮、生物堿等化合物，生成甲基化酚類代謝物[1-2]。茶葉中甲基化表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，主要是(－)-表沒食子兒茶素3-(3--甲基)沒食子酸酯(EGCG3"Me)，只有少數(shù)茶樹種質(zhì)資源的EGCG3"Me含量在1%以上[3-5]。SAIJO[6]首次從綠茶中分離出EGCG3"Me；后續(xù)的研究表明其抗過敏、抗炎效果強(qiáng)于EGCG[7-11]。與化學(xué)合成方法相比，運(yùn)用酶工程技術(shù)合成EGCG3"Me，反應(yīng)條件相對(duì)溫和、安全，過程簡單，后期產(chǎn)物的純化也較為簡易。ZHANG等[12]通過克隆茶樹咖啡酰輔酶A--甲基轉(zhuǎn)移酶基因()，在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了相對(duì)分子質(zhì)量約28 000的重組蛋白；進(jìn)一步研究蛋白的催化活性，重組茶樹CCoAOMT能夠催化EGCG生成甲基化EGCG，且EGCG3"Me生成量相對(duì)較高。

筆者以報(bào)道的茶樹CCoAOMT基因序列為根據(jù)，構(gòu)建了重組融合表達(dá)載體pET-28a-，優(yōu)化其原核表達(dá)條件，并利用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行分離純化，獲得具有催化活性的重組蛋白，優(yōu)化重組酶CCoAOMT體外催化EGCG合成EGCG3"Me的反應(yīng)條件，以期為生物合成EGCG3"Me提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

‘金牡丹’茶樹一芽二葉(夏季)，采自湖南省茶葉研究所；大腸桿菌BL21(DE3)為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；EGCG和EGCG3"Me標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma產(chǎn)品；SAM為上海生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1重組表達(dá)載體的構(gòu)建

提取茶樹鮮葉總RNA，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得茶樹cDNA。根據(jù)NCBI提供的序列號(hào)JQ 790528.1設(shè)計(jì)引物，上游引物為5′-CGCGGATCCATGGCAACAAACGGAGA A-3′，下游引物為5′-GGCTCGAGTCAGCAGACG CCGGGC-3′，酶切位點(diǎn)為HI、I，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收PCR產(chǎn)物。利用平末端T載體連接CCoAOMT基因并轉(zhuǎn)化至Transl-T1感受態(tài)細(xì)胞中，提取陽性克隆菌Transl-T1質(zhì)粒并測序。重組質(zhì)粒-T及pET-28a載體經(jīng)雙酶切后進(jìn)行回收純化。T4DNA連接酶連接質(zhì)粒與載體雙酶切產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化至DH 5α，提取陽性菌落質(zhì)粒，最終獲得表達(dá)載體pET-28a-。

1.2.2原核表達(dá)條件的優(yōu)化及蛋白純化

重組質(zhì)粒pET-28a-轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)，經(jīng)含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，挑選陽性單菌落，在3 mL液體培養(yǎng)基(Kan+)試管中過夜培養(yǎng)。取3 μL培養(yǎng)液在3 mL LB液體培養(yǎng)基(100 mg/L Kan+)中培養(yǎng)3 h后冰上放置2 min，分別加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L，37 ℃、180 r/min誘導(dǎo)4 h后離心，收集菌體。菌體冰上放置，待菌體重懸后超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，破壁蛋白沉淀部分同樣進(jìn)行重懸。沉淀液與上清液于100 ℃水浴10 min，使蛋白變性，水浴結(jié)束，沉淀液12 000 r/min室溫離心15 min后，取上清。SDS-PAGE電泳(12%分離膠、5%濃縮膠)檢測上清液及沉淀液上清。繼而對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。

將Ni-NTA樹脂重懸放置于層析柱，加入洗脫液沖洗多次。上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，加入Ni-NTA樹脂。上樣完成后用蛋白洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，封閉層析柱下端靜置。收集分次洗脫樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.3酶促反應(yīng)條件優(yōu)化

15 mL反應(yīng)體系中(含1.2 mmol/L SAM、0.2 mmol/L MgCl2)加入1 mL由重組質(zhì)粒pET-28a-轉(zhuǎn)化至BL21誘導(dǎo)表達(dá)后保留的菌種經(jīng)超聲破碎的上清液，EGCG濃度設(shè)置為0.01、0.03、0.05、0.07、0.10、0.15 mmol/L，37 ℃水浴恒溫1.5 h，加入200 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)，并用20 mL乙酸乙酯萃取，離心、旋轉(zhuǎn)濃縮干燥萃取液，用0.2 mL甲醇溶解后過膜，按文獻(xiàn)[13]方法對(duì)產(chǎn)物EGCG3"Me的生成量進(jìn)行HPLC分析。選用最佳EGCG濃度，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度為25、35、37、40、45 ℃，選用最佳EGCG濃度和溫度，使用檸檬酸-磷酸鹽調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，進(jìn)行反應(yīng)和HPLC分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　pET-28a-CCoAOMT重組質(zhì)粒的鑒定

CCoAOMT基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，獲得了900 bp左右的特異性條帶。轉(zhuǎn)化至Transl-T1，提取質(zhì)粒并測序，雙酶切重組正確質(zhì)粒和pET-28a載體，再把酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化至DH 5α進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，經(jīng)測序驗(yàn)證序列，結(jié)果(圖1)表明，成功構(gòu)建了pET-28a-重組質(zhì)粒。

1～3　隨機(jī)挑選的單菌落；4　DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶。

2.2　重組茶樹pET-28a-CCoAOMT的誘導(dǎo)表達(dá)

對(duì)誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在37 ℃下誘導(dǎo)4 h，蛋白表達(dá)效果最佳，進(jìn)而用于篩選IPTG濃度。不同的IPTG終濃度誘導(dǎo)下，在BL21中均得到表達(dá)(圖2)。上清液及沉淀蛋白中都存在特異性條帶，所得的重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為28 000，與理論值相符。上清液和沉淀中均存在重組蛋白，表明重組蛋白CCoAOMT是以包涵體形式存在的。比較發(fā)現(xiàn)，重組蛋白在上清液和沉淀中表達(dá)差異明顯，上清液中的表達(dá)量相對(duì)較高。IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)，上清和沉淀部分的蛋白表達(dá)量均較高，而后提高誘導(dǎo)劑濃度，差異并不明顯?？梢姡亟M質(zhì)粒最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間4 h，IPTG終濃度0.5 mmol/L。

A　上清液部分；B　沉淀部分；M　蛋白標(biāo)準(zhǔn)條帶；1~5　IPTG終濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L。

2.3　重組蛋白CCoAOMT的純化

表達(dá)菌株BL21擴(kuò)大誘導(dǎo)后，利用Ni-NTA親和色譜柱純化蛋白。圖3為重組蛋白分次洗脫的SDS-PAGE電泳圖譜。泳道5為經(jīng)梯度洗脫純化后的蛋白，其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為28 000，與理論值相符。Ni-NTA樹脂基本能吸附重組蛋白。2次洗脫后，大腸桿菌內(nèi)及反應(yīng)中的雜蛋白基本洗脫，第3次洗脫少量蛋白被洗脫出來，說明重組蛋白易洗脫。目的蛋白經(jīng)Elute Buffer第4次洗脫時(shí)基本洗脫，而Wash Buffer洗脫液僅洗脫出少量的目的蛋白。

M　蛋白標(biāo)準(zhǔn)條帶；1　上清液；2　第1次洗脫液；3　第2次洗脫液；4　第3次洗脫液；5　第4次洗脫液。

2.4　酶促產(chǎn)物的HPLC分析

圖4為反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜。在EGCG3"Me對(duì)照品相應(yīng)保留時(shí)間25 min左右處可見1個(gè)色譜峰，經(jīng)HPLC分析，鑒定為EGCG3"Me，表明重組蛋白CCoAOMT具有生物學(xué)活性，能催化EGCG生成EGCG3"Me。

圖4　EGCG酶促反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜

2.5　不同酶促反應(yīng)條件下的產(chǎn)物生成量

從表1可以看出，當(dāng)EGCG濃度為0.05 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)11.1%；繼續(xù)提高EGCG濃度，EGCG轉(zhuǎn)化率反而降低。不同酶促溫度下，EGCG3"Me生成量35 ℃至37 ℃增幅較大，37 ℃時(shí)EGCG3"Me生成量最大；而后再提高溫度，EGCG3"Me生成量降低。酶促反應(yīng)體系pH值從3.0增加到4.0時(shí)，EGCG3"Me生成量增加并出現(xiàn)最高值；而后繼續(xù)升高pH值，EGCG3"Me生成量下降；pH為4.0時(shí)，酶促活性最佳，EGCG3"Me生成量最高。由此可見，該酶促反應(yīng)最佳的底物濃度為0.05 mmol/L，溫度為37 ℃，酶促pH值為4.0。

表1　不同酶促反應(yīng)條件下的EGCG轉(zhuǎn)化率和EGCG3"Me生成量

3　結(jié)論與討論

對(duì)重組在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為37 ℃下誘導(dǎo)4 h ，IPTG終濃度為0.5 mmol/L。利用Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫達(dá)到了較好的純化效果。用重組CCoAOMT，以EGCG為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，重組酶能催化EGCG生成EGCG3"Me，且最佳的EGCG底物濃度為0.05 mmol/L，酶促溫度為37 ℃，酶促pH值為4.0。

大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)體系中，誘導(dǎo)溫度和時(shí)間、IPTG濃度均能影響目的蛋白的表達(dá)[14-16]。本研究在成功構(gòu)建重組融合表達(dá)載體pET-28a-的基礎(chǔ)上，使用優(yōu)化后的誘導(dǎo)溫度(37 ℃)和誘導(dǎo)時(shí)間(4 h)，改變IPTG終濃度，分析了重組茶樹誘導(dǎo)表達(dá)的最佳IPTG終濃度。結(jié)果表明，同一IPTG終濃度條件下，目的蛋白在上清液中表達(dá)量均較沉淀部分高，差異明顯；不同IPTG終濃度條件下，上清液中的蛋白表達(dá)量在0.5～1.0 mmol/L，表達(dá)穩(wěn)定，繼續(xù)增大IPTG濃度，對(duì)蛋白的表達(dá)量影響不明顯。考慮到IPTG誘導(dǎo)劑具有潛在毒性，最終確定其最低有效誘導(dǎo)終濃度為0.5 mmol/L，即在大腸桿菌中的最佳表達(dá)條件為37 ℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h。

重組蛋白CCoAOMT經(jīng)Ni-NTA親和層析柱梯度洗脫，達(dá)到了較好的純化效果，呈現(xiàn)出單一的目的蛋白條帶，純化后的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為28 000。使用梯度咪唑洗脫，可以控制Ni柱中結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量，從而對(duì)目標(biāo)蛋白的結(jié)合效率進(jìn)行調(diào)整，以達(dá)到純化重組蛋白的目的[17]。洗脫液中咪唑濃度較高，有助于目的蛋白的洗脫。對(duì)重組蛋白的活性進(jìn)行驗(yàn)證，以主要的酶促產(chǎn)物EGCG3"Me生成量為指標(biāo)，進(jìn)一步探究其體外酶促反應(yīng)條件，結(jié)果顯示，重組蛋白CCoAOMT能催化EGCG生成EGCG3"Me，重組酶具有催化活性，酶促反應(yīng)的最佳EGCG底物濃度為0.05 mmol/L，酶促溫度為37 ℃，酶促pH值為4.0。

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Prokaryotic expression offromand optimization of enzymatic conditions

TANG Qian1,2,4, CHEN Si1,2,4, OU Shuqiong1,2,4, LI Qin1,2,3,4, LI Juan1,2,3,4*, WANG Kunbo1,2,3,4*

(1.National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Key Laboratory of Education Ministry for Tea Science, Changsha, Hunan 410128, China; 3.Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha, Hunan 410128, China; 4.Horticulture College, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

The expression of the recombinant caffeinyl-coenzyme A-methyltransferase gene() incells was optimized and the enzyme was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The enzymatic reaction was carried out in vitro with epigallocatechin gallate (EGCG) as substrate, and EGCG3"Me, the reaction products, were analyzed by HPLC. As a result,was highly expressed inBL21 andthe best induction conditions of recombinantwas 0.5 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 h. The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The recombinant CCoAOMT could catalyze EGCG to EGCG3"Me in vitro and the optimal reaction conditions include substrate EGCG of 0.05 mmol/L, pH of 4 andtemperature of 37 ℃.

; caffeinyl-coenzyme A-methyltransferase; prokaryotic expression; purification; enzymatic synthesis

S571.101

A

1007-1032(2020)05-0533-05

唐倩，陳絲，歐淑瓊，李勤，李娟，王坤波．茶樹原核表達(dá)及酶促條件優(yōu)化[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(5)：533-537．

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http://xb.hunau.edu.cn

2019-11-22

2020-08-01

國家科學(xué)技術(shù)部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2018YFC1604403)；湖南省科學(xué)技術(shù)廳中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展項(xiàng)目(2019XF5041)；湖南省科學(xué)技術(shù)廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018NK2031)

唐倩(1996—)，女，湖南郴州人，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究，250482928@qq.com；*通信作者，李娟，博士，講師，主要從事茶樹資源及分子生物學(xué)研究，xixi_lj@126.com；*通信作者，王坤波，博士，教授，主要從事茶樹分子生物學(xué)和次生代謝研究，wkboo163@163.com

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維