王林剛，杜三威，任家正

（河南紅陽(yáng)工業(yè)有限責(zé)任公司職工醫(yī)院外科，河南 南陽(yáng)474678）

miRNA 是人類的一組小單鏈RNA，可與靶向mRNA 相互集合，并誘導(dǎo)mRNA 降解，或抑制蛋白質(zhì)翻譯，并以此調(diào)整下游基因的表達(dá)，形成多種病理生理功能，如作用造血系統(tǒng)分化，促進(jìn)胰島素合成，參與細(xì)胞增殖、分化以及凋亡等[1]。miRNA 在腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在高或低表達(dá)情況，并生成抑癌或促癌效應(yīng)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[2，3]。 微小 RNA-92a（miR-92a）是miRNA 家族成員之一，臨床業(yè)已證實(shí)，miR-92a 與乳腺癌、肺癌以及胰腺癌等腫瘤疾病密切相關(guān)[4]。 但miR-92a 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平如何，其與患者腫瘤惡性程度指標(biāo)間的聯(lián)系如何，臨床研究較少。 為此本研究選取我院獲取的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本90 例、90 例結(jié)直腸癌癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2016 年 1 月至 2017 年 12 月我院獲取的90 例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本和結(jié)直腸癌癌旁組織標(biāo)本。

90 例結(jié)直腸癌患者，年齡 36～76 歲，平均 54.8±10.0 歲，男 56 例、女 34 例，TNM 分期：Ⅰ期 21 例、Ⅱ期37 例、Ⅲ期26 例、Ⅳ期6 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性43 例；分化程度：低分化35 例、中分化28 例、高分化27 例；腫瘤直徑≥5cm 49 例；其中結(jié)腸癌55 例、直腸癌35 例；術(shù)后1 年隨訪出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移24 例。

入選標(biāo)準(zhǔn)： ⑴結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社《外科學(xué)》第八版中的標(biāo)準(zhǔn)；⑵經(jīng)結(jié)直腸鏡檢查及手術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)； ⑶在獲取患者的病理學(xué)標(biāo)本前，患者未接受放化療、免疫學(xué)治療；⑷患者的病理學(xué)資料、病例記錄等完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴伴有其他部位的惡性腫瘤；⑵資料缺失、無法統(tǒng)計(jì)分析的患者；⑶伴有結(jié)直腸其他類型疾病。

1.2 RT-qPCR 方法 采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)并計(jì)算兩組標(biāo)本中的miR-92a 相對(duì)表達(dá)量，具體操作如下：根據(jù)TRIzol法檢測(cè)樣本總RNA，參照上海生工提供的RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 取各組樣本2μg 總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件參照如下：42℃，60min；72℃，10min。 取 2μl cDNA 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)， 條件參照如下:50℃，2min；75℃，10min，95℃，15s；60℃，1min，共38 個(gè)循環(huán)。 隨后選用西安天隆科技有限公司提供的熒光定量PCR 儀檢測(cè)結(jié)果。并分析腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期的結(jié)直腸癌組織中的miR-92a 表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用美國(guó)IBM SPSS 公司的統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS21.0 版本對(duì)本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用±s 表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，應(yīng)用t 檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析； 應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析計(jì)數(shù)資料；繪制ROC 曲線分析miR-92a 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的價(jià)值。 P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織中的miR-92a 表達(dá)差異結(jié)腸癌癌組織中的miR-92a 相對(duì)表達(dá)量顯著的高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1、圖1。

表1 癌組織和癌旁組織中的miR-92a 表達(dá)差異（±s，2-△△ct）

表1 癌組織和癌旁組織中的miR-92a 表達(dá)差異（±s，2-△△ct）

組別 n癌組織癌旁組織P 值90 90 miR-92a t 值0.894±0.204 0.371±0.116 21.1430.000

圖1 癌組織和癌旁組織中的miR-92a 表達(dá)情況，1、2 為癌旁組中的U6 表達(dá)，3 為結(jié)腸癌組織中的miR-92a 表達(dá)，4 為癌旁組織中的miR-92a 表達(dá)

2.2 不同病理學(xué)特征及預(yù)后的結(jié)腸癌癌組織的miR-92a 相對(duì)表達(dá)量差異 Ⅲ+Ⅳ期、低分化、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后12 個(gè)月有復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌癌組織中的miR-92a 相對(duì)表達(dá)量顯著的高于Ⅰ+Ⅱ期、高+中分化、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在不同結(jié)直腸癌腫瘤直徑的結(jié)腸癌組織中的miR-92a 相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。 見表2。

表2 不同病理學(xué)特征及預(yù)后的結(jié)腸癌癌組織的miR-92a 相對(duì)表達(dá)量差異（±s，2-△△ct）

表2 不同病理學(xué)特征及預(yù)后的結(jié)腸癌癌組織的miR-92a 相對(duì)表達(dá)量差異（±s，2-△△ct）

病理學(xué)特征 n TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期分化程度高+中低分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移miR-92a t 值P 值58 32 0.840±0.188 0.967±0.1923.0450.003 55 35 0.852±0.174 0.957±0.1962.6560.009是 否43 47 0.977±0.201 0.815±0.1843.9920.000腫瘤直徑≥5cm＜5cm術(shù)后12 個(gè)月復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移49 41 0.910±0.163 0.870±0.1921.0690.288有 無24 66 0.989±0.188 0.803±0.1924.0860.000

2.3 miR-92a 相對(duì)表達(dá)量對(duì)結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值 根據(jù)12 個(gè)月隨訪結(jié)果，通過繪制ROC 曲線確定miR-92a 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的臨界值，以大于臨界值者為有復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，否則為無復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，結(jié)果顯示，以miR-92a 相對(duì)表達(dá)量臨界值 0.904（2-△△ct）預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者術(shù)后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的ROC 曲線下面積AUC 值為 0.861（0.824～0.918），靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 和 陰 性 預(yù) 測(cè) 值 分 別 為 0.750、0.818、0.600 和0.900。 見圖2。

圖2 miR-92a 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)患者發(fā)生復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的ROC 曲線

3 討論

結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展與多種癌基因激活，抑癌基因突變、失活以及細(xì)胞周期調(diào)控基因突變有關(guān)[5]。大量研究顯示，結(jié)直腸癌患者存在多種miRNA 表達(dá)情況，這些miRNA 的靶基因參與著結(jié)直腸細(xì)胞的惡性化、分化以及轉(zhuǎn)移[6，7]。 miR-92a 屬于 miR-17-92 基因簇的一員，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a、miR-363 在結(jié)直腸癌組織及血漿內(nèi)存在明顯高表達(dá)情況[8]。 本組研究中，結(jié)腸癌癌組織中的miR-92a 相對(duì)表達(dá)量水平顯著的高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與相關(guān)研究結(jié)果相似，表明miR-92a 是結(jié)直腸癌重要參與因子。miR-92a 是促癌基因的一種，可有效增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞活力，并促其集落的生成[9]。 miR-92a 參與結(jié)直腸癌病變的作用機(jī)制尚不明確，但可能為：miR-92a 可通過mTOR 信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)以分裂[10]。 mTOR 是細(xì)胞內(nèi)的一種絲氨酸/絡(luò)氨酸激酶， 其是多種信號(hào)路徑的參與因子，這些信號(hào)路徑參與著細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)分裂，血管新生以及細(xì)胞自噬等多種生物效應(yīng)[11]。

miRNA 可靶向調(diào)控血管生成因子及蛋白激酶的表達(dá)，并促進(jìn)或抑制腫瘤血管新生[12，13]。有研究發(fā)現(xiàn)[14]，惡性轉(zhuǎn)化的腸道細(xì)胞內(nèi)可見miR-17-92 基因簇，并且這些基因簇可有效促進(jìn)腫瘤血管新生。本組研究中，Ⅲ+Ⅳ期、低分化、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌癌組織中的miR-92a 相對(duì)表達(dá)量水平顯著的高于Ⅰ+Ⅱ期、高+中分化、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-92a相對(duì)表達(dá)量水平與患者腫瘤惡性程度密切相關(guān)，miR-92a 或可用于評(píng)估結(jié)直腸癌患者惡性程度。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，結(jié)直腸癌患者miR-92a 表達(dá)水平顯著增高，并且與患者TNM 分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及生存期相關(guān)， 進(jìn)一步的研究顯示，miR-92a 或可用于鑒別轉(zhuǎn)移或非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，這與本組研究結(jié)果相似。miR-92a 可靶向調(diào)節(jié)磷酸酶和張力蛋白同源性蛋白表達(dá)， 并以此負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/AKt 信號(hào)路徑內(nèi)的磷酸化蛋白表達(dá)，最終影響細(xì)胞增殖、分化以及凋亡[16，17]。 有研究發(fā)現(xiàn)[18]，miR-92a 高表達(dá)的上清液可有效增強(qiáng) HUVEC 小管的生成能力， 表明miR-92a 或可通過促進(jìn)腫瘤微小血管新生，增強(qiáng)腫瘤增殖、分化能力。 有研究發(fā)現(xiàn)[19]，結(jié)直腸癌miR-92a 表達(dá)水平與患者磷酸酶和張力蛋白同源性蛋白表達(dá)水平負(fù)向相關(guān)，表明miR-92a 可通過抑制磷酸酶和張力蛋白同源性蛋白表達(dá)來促進(jìn)結(jié)直腸癌血管新生，最終參與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移。 還有研究發(fā)現(xiàn)[20]，結(jié)直腸癌細(xì)胞可合成含有miR-92a 的微泡，這些微泡可與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合， 并下調(diào)Dkk-3基因表達(dá)，并增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，為腫瘤血管新生提供有利微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。 但本組研究發(fā)現(xiàn)， 在不同結(jié)直腸癌腫瘤直徑的結(jié)腸癌組織中的miR-92a 表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-92a 與患者病灶體積無相關(guān)性， 其原因可能與不同病灶體積內(nèi)的新生血管平均密度相似有關(guān)，還可能與本組研究樣本數(shù)量較小有關(guān)。

本研究通過RT-qPCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織內(nèi)miR-92a 相對(duì)表達(dá)量水平顯著高于癌旁組織，其可通過作用mTOR 信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)以分裂， 還可通過多種路徑促進(jìn)腫瘤血管新生，最終參與腫瘤增殖、分化。 因此，miR-92a 或可成為結(jié)直腸癌新的診斷標(biāo)志物及靶向治療新方向。隨訪12 個(gè)月顯示，miR-92a 相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者術(shù)后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的ROC 曲線下面積AUC 值為0.861，對(duì)應(yīng)的截?cái)嘀禐?.904，其靈敏度和特異度分別為0.750 和0.818，提示miR-92a 或可作為結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述， 結(jié)直腸癌組織中miR-92a 呈高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌的惡性程度有關(guān)，同時(shí)對(duì)結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。