畢春燕，任國平，袁杜霞

（新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院產科，河南 新鄉(xiāng) 453000）

臨床上子癇前期的發(fā)病具有高基礎發(fā)病率和高病死率的特征，在具有家族性高血壓或者代謝系統(tǒng)疾病的群體中，子癇前期的發(fā)病率可持續(xù)上升[1]。臨床上子癇前期的發(fā)生，不僅能夠導致胎兒或者新生兒妊娠結局的惡化，同時還能夠加劇母體心力衰竭或者腦血管意外的發(fā)生[2]。 通過對于子癇前期臨床病情的評估，能夠為臨床上子癇前期的早期臨床干預提供參考契機。 肌肉生長抑素（MSTN）是生長因子家族成員，其能夠通過誘導下游炎癥性信號通路NF-KB 的激活，加劇下游P53 蛋白的激活，促進胎盤組織絨毛膜滋養(yǎng)細胞的氧化應激性損傷[3]；G蛋白信號通路調節(jié)蛋白5（RGS5）是鳥苷酸信號通路調節(jié)蛋白，其能夠通過誘導G 蛋白歐聯結構的異常，影響到胎盤血管內皮細胞的損傷修復[4]。 為了揭示胎盤組織中MSTN、RGS5 的表達與子癇前期的病情關系，從而為臨床上子癇前期的病情評估提供依據，本次研究選取我院確診并分娩的輕度子癇前期產婦，探討了胎盤組織中MSTN、RGS5 的表達情況。

1 資料與方法

1.1 資料 選取我院 2015 年 7 月-2019 年 2 月確診并分娩的輕度子癇前期產婦47 例為輕度組、重度子癇前期產婦41 例為重度組、60 例正常妊娠分娩產婦為對照組。 納入標準：⑴子癇的診斷標準參考中華婦產科學分會制定的標準[5]，輕度子癇前期：妊娠 20 周后出現≥140/90mmHg， 且尿蛋白≥300mg/24h 或（+），可伴有上腹部不適、頭痛、視力模糊等癥狀; 重度子癇前期： 妊娠20 周后出現≥160/110mmHg，且尿蛋白≥2000mg/24h 或（++），血肌酐＞106μmol/L，血小板＜100×109/L，血清乳酸脫氫酶（LDH）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平升高，持續(xù)性頭痛、視覺及神經功能障礙、腹痛等；⑵在我院接受分娩并獲取胎盤組織；⑶單胎妊娠；⑷本研究經醫(yī)學倫理委員會批準同意。 排除標準：⑴伴有妊娠期糖尿病等其他類型的合并組；⑵伴有肝炎、結核等傳染性疾病；⑶伴有染色體相關疾??；⑷伴有其他系統(tǒng)的重大疾病輕度組，產婦年齡 22～37 歲，平均 28.2±2.0歲； 分娩孕周 34～37 周， 平均 36.4±1.0 周； 孕次3.11±1.63 次；產次 1.37±0.60 次。重度組，產婦年齡22～39 歲，平均 28.4±2.5 歲；分娩孕周 32～37 周，平均 34.8±1.1 周；孕次 3.04±1.57 次；產次 1.29±0.58次。對照組 ，產婦年齡 22～37 歲，平均 28.5±2.6 歲；分娩孕周 38～41 周，平均 38.4±1.0 周；孕次 3.00±1.63 次;產次 1.37±0.60 次。三組產婦的年齡、孕次、產次比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；三組產婦的分娩孕周差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

1.2 方法

1.2.1 Western-blot 檢測方法 搜集的標本組織采用液氮保存，采用蛋白提取試劑盒進行蛋白提取，BCA 法調整蛋白濃度， 提取的蛋白與SDS 緩沖液混合10min，SDS-PAGE 電泳分離檢測蛋白，醋酸纖維膜進行蛋白的轉移，清洗膜后采用5%的血清蛋白進行封閉，TBST 清洗3 次，每次5min，加入一抗（鼠抗人 MSTN 單克隆抗體， 濃度 1:500， 鼠抗人RGS5 單克隆抗體，濃度 1:2000，均由 Novus 公司生 產 ）5ml，4℃冰 箱 過 夜 ，TBST 清 洗 3 次， 每 次5min，加入二抗（羊抗鼠辣根過氧化物酶標記的IgG抗體，濃度：1:2000，由北京博爾西科技有限公司生產）3ml，TBST 清洗 3 次，每次 5min，加入 DAB 顯影液（北京索萊寶科技有限公司），以GADPH 蛋白為內參，采用GSG2000 核酸/蛋白凝膠圖像分析管理軟件掃描分析蛋白條帶灰度值，并以MSTN、RGS5蛋白灰度值與GADPH 蛋白灰度值比值分別計算蛋白水平的相對表達量。

1.2.2 免疫組化檢測 將10%福爾馬林固定的組織制成玻片，常規(guī)進行脫水、浸蠟、包埋、切片、烤片，取出后翻入玻片盒保存。 采用免疫組化SP 法對組織MSTN、RGS5 蛋白進行定性定位。將制備好的玻片常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇脫水，然后常規(guī)用PBS 緩沖液重復浸泡3 次，5min/次。 將切片置入保濕盒，滴加3%雙氧水，37℃恒溫箱孵育10min，用PBS 緩沖液重復浸泡 3 次，5min/次。 置 0.01M PH6.0 枸櫞酸緩沖液中煮沸， 維持15min， 然后自然冷卻＞20 min，可用冷水沖洗缸子快速降至室溫，常規(guī)PBS 沖洗3 次。 盡可能用紙巾完全去除緩沖液，滴加山羊血清封閉液以包圍組織，37℃恒溫孵育10min。 用紙巾盡可能擦去殘留液體，將兩張切片標記編號后分別滴加一抗（鼠抗人MSTN 單克隆抗體，濃度：1:200，鼠抗人 RGS5 單克隆抗體，濃度 1:500，均由Novus 公司生產），4℃冰箱過夜孵育，常規(guī) PBS 沖洗3 次（用PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照），加入生物素熒光標記的二抗 （羊抗鼠辣根過氧化物酶標記的IgG 抗體，濃度1:500，由北京博爾西科技有限公司生產），37℃孵育 30min， 常規(guī) PBS 沖洗 3次，加入Streptavidin/HRP 辣根酶標記鏈霉卵白素，37℃孵育30min，常規(guī)PBS 沖洗3 次。增強型HRPDAB 底物顯色試劑盒 (PA110)顯色，自來水沖洗，常規(guī)蘇木素復染、脫水、透明、干燥、封片。 在顯微鏡400 倍視野下選擇任意5 個視野，每個視野計數200 個細胞，陽性表達判斷采用半定量積分法。MS TN、RGS5 蛋白陽性表達著色主要定位于細胞膜和細胞漿，讀片評分標準：⑴根據著色強度：0 分為無色，1 分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為褐色、黑色；⑵根據陽性細胞比例：陽性細胞數目占比≤10%計1 分，陽性細胞占比為11%～50%計2 分，陽性細胞數占比為51%～75%計3 分，陽性細胞數占比＞75%計4 分。 兩種積分相乘總分＜3 分視為陰性，≧3 分視為陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS 21.0 軟件，三組的年齡、MSTN、RGS5 蛋白等指標采用±s 表示，三組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗， 相關性分析法采用Pearson線性相關分析法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組產婦的產前24h 尿蛋白定量、 產后血壓恢復正常時間比較 重度組、輕度組的產前24h 尿蛋白定量高于對照組（P＜0.05），重度組的產前24h尿蛋白定量高于輕度組（P＜0.05）；重度組的產后血壓恢復正常時間長于輕度組（P＜0.05）。 見表1。

表1 三組產婦的產前24h 尿蛋白定量、產后血壓恢復正常時間比較(±s)

表1 三組產婦的產前24h 尿蛋白定量、產后血壓恢復正常時間比較(±s)

組別 n對照組輕度組重度組F/t 值P 值60 47 41產前24h 尿蛋白定量（g） 產后血壓恢復正常時間（d）0.29±0.13 0.94±0.31 2.95±0.70 58.904 0.000-7.31±2.20 11.84±3.90-6.819 0.000

2.2 三組產婦胎盤組織中的MSTN、RGS5 蛋白檢測結果對比 重度組、 輕度組胎盤組織中的MSTN表達高于對照組（P＜0.05），重度組胎盤組織中的M STN 蛋白表達高于輕度組（P＜0.05）；重度組、輕度組胎盤組織中的RGS5 表達低于對照組（P＜0.05），重度組胎盤組織中的RGS5 表達低于輕度組 （P＜0.05）。 見表2、圖1、圖2。

2.3 子癇前期產婦胎盤組織MSTN、RGS5 蛋白與產前24h 尿蛋白定量、 產后血壓恢復正常時間的相關性 子癇前期產婦胎盤組織中MSTN 表達與產前24h 尿蛋白定量、 產后血壓恢復正常時間呈正相關關系 （P＜0.05），RGS5 表達與產前 24h 尿蛋白定量、產后血壓恢復正常時間呈負相關關系（P＜0.05）。 見表3。

表2 三組產婦胎盤組織中的MSTN、RGS5蛋白檢測結果對比（±s，相對表達量）

表2 三組產婦胎盤組織中的MSTN、RGS5蛋白檢測結果對比（±s，相對表達量）

組別 n對照組輕度組重度組F 值P 值60 47 41 MSTN RGS5 0.983±0.337 1.538±0.558 2.704±0.761 44.298 0.000 1.661±0.532 0.970±0.295 0.584±0.177 34.085 0.000

圖1 A 為對照組、B 為輕度組、C 為重度組，MSTN 蛋白在胎盤組織中的免疫組化結果，可見輕度組和重度組中的MSTN 蛋白表達強度明顯增強

圖2 A 為對照組、B 為輕度組、C 為重度組，RGS5 蛋白在胎盤組織中的免疫組化結果，可見輕度組和重度組中的RGS5 蛋白表達強度明顯減弱

表3 相關性分析結果

3 討論

妊娠期血管內皮細胞氧化應激性損傷、 血流動力學的紊亂，均能夠促進子癇前期的發(fā)生。 在具有多胎妊娠或者妊娠期糖尿病的群體中，子癇前期的發(fā)病風險可進一步的上升[6]。 臨床上子癇前期導致的胎兒宮內生長發(fā)育遲緩、 胎兒宮內窘迫的發(fā)生，能夠顯著加劇新生兒臨床結局的惡化[7，8]。 現階段對于子癇前期的基礎方面的研究較少，雖然尿蛋白或者24h 尿蛋白定量能夠在子癇前期的病情評估過程中發(fā)揮作用，但其無法揭示子癇前期病情進展的內在機制[9]。 胎盤組織中相關分子標志物的改變，能夠在胎盤血管的螺旋化改變、胎盤組織絨毛膜滋養(yǎng)細胞的損傷方面發(fā)揮作用。 本次研究通過對于子癇前期患者胎盤組織中MSTN、RGS5 的表達分析研究，具有下列方面的現實意義：⑴能夠進一步揭示子癇前期的病情進展原理，從而為疾病的預防提供一定的參考;⑵能夠為臨床上子癇前期患者的病情評估提供新的參考指標，并有利于為子癇前期的生物學治療提供依據。

MSTN 是生長抑素相關調控家族成員，其對于胰島素樣生長因子或者血管內皮生長因子的抑制作用，能夠抑制胎盤血管內皮細胞的新生和修復過程。MSTN 還能夠影響到局部炎癥性因子的富集過程， 誘導局部炎癥性因子的浸潤激活程度；RGS5是G 蛋白偶聯蛋白家族成員，其對于下游鳥苷酸或者核苷酸代謝信號通路的影響，能夠干預到胎盤絨毛膜滋養(yǎng)細胞的分化過程。 有研究試圖探討了MSTN 在子癇前期或者妊娠期高血壓患者中的表達情況，認為MSTN 的表達上升能夠顯著促進妊娠期高血壓患者病情的進展[10]，但對于RGS5 的分析較少。

在不同病情的子癇前期患者中，其24h 尿蛋白定量水平明顯的上升，特別是在重度子癇前期患者中，24h 尿蛋白定量的表達濃度上升更為顯著，提示了子癇前期患者腎功能的損害情況。 而重度組子癇前期患者其血壓恢復時間也明顯的延長，明顯長于輕度組子癇前期孕產婦。 本次研究重點探討了MSTN、RGS5 的表達變化，發(fā)現在子癇前期患者中，胎盤組織中MSTN 的表達濃度明顯的上升，而RGS5 的表達濃度明顯的下降，特別是在重度組子癇前期孕產婦中，MSTN 蛋白的表達濃度上升更為顯著，而RGS5 蛋白的表達濃度下降也更為明顯，提示了MSTN、RGS5 蛋白的改變對于子癇前期患者病情的影響。MSTN 的表達上升對于胎盤血管重塑化障礙的影響，主要由于其能夠影響到胎盤血管間質組織的纖維化，導致胎盤血管管壁的狹窄和管壁彈性的下降，促進了妊娠期血壓的波動[11]；而RG S5 的下降對于子癇前期的病情影響， 主要由于其能夠影響到G 蛋白內信號通路AKT 的激活，加劇下游腫瘤壞死因子a 的釋放，最終促進滋養(yǎng)細胞的凋亡和胎盤血管的病變，加劇子癇前期的病情進展[12，13]。 有其他研究者也認為，在子癇前期孕產婦中，RGS 蛋白的表達濃度可下降30%，在具有顯著胎兒宮內生長發(fā)育遲緩的孕產婦中， 胎盤組織中RGS蛋白的表達濃度下降更為顯著[14，15]。 免疫組化染色分析可見，MSTN、RGS5 主要定位于胎盤血管內皮細胞周圍， 在內皮細胞凋亡較為明顯的區(qū)域，MSTN、RGS5 的染色強度可明顯上升。 相關關系分析發(fā)現，MSTN 與孕產婦24h 尿蛋白呈正相關，而RGS5 與孕產婦24h 尿蛋白呈負相關，進一步提示了MSTN、RGS5 的表達與子癇前期孕產婦的病情關系。

子癇前期產婦胎盤組織中的MSTN 表達增強、RGS5 表達下調可能與子癇發(fā)病有關，并且與患者病情程度及預后血壓恢復有一定的關系。